摘要
瓜类细菌性果斑病（Bacterial fruit blotch，BFB）是由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)引起的检疫性细菌病害，由于该病害分布广泛、传播快速、为害严重，对西甜瓜相关产业的发展造成了重大影响。 DeoR（Deoxyribonucleoside operon repressor）家族转录调控因子在细菌中广泛存在。在功能上，其既可作为局部的特异性调控因子，也可作为全局的多效性调控因子，可以通过结合启动子DNA的特定序列来转录抑制或者激活靶基因的转录表达，在细菌致病过程、果糖代谢和抗胁迫过程中发挥着重要作用。果糖代谢在生命活动中具有重要意义，果糖磷酸转移酶系统（PTSFru）由fruA和fruB组成，果糖在细菌中首先通过磷酸转移酶系统将果糖运输并磷酸化为果糖-1-磷酸，再进入下一步代谢过程。 目前，在西瓜噬酸菌中关于DeoR家族转录调控因子以及果糖磷酸转移酶系统（PTSFru）的研究仍然较少，本研究以西瓜噬酸菌Aac5菌株为研究对象，构建了glpR、fruA和fruB的基因敲除菌株和互补菌株，同野生菌株一起进行了致病相关表型的测定，并通过qRT-PCR、GUS酶活等分析其可能参与的调控。主要研究结果如下： 1、西瓜噬酸菌基因glpR、fruA和fruB的生物信息学分析 用 NCBI 分析 A. citrulli Ⅱ 组模式菌株 AAC00-1 基因组发现了 1 个 DeoR 家族转录因子glpR，为Aave_0603，有一个保守的HTH结构域，能够和DNA结合；组成果糖磷酸转移酶系统（PTSFru）的基因为fruA和fruB，分别为Aave_4250、Aave_4252，均具有PFAM结构域用于运输并磷酸化果糖。 2、西瓜噬酸菌glpR、fruA和fruB缺失突变菌株、互补菌株构建及功能分析 以西瓜噬酸菌Aac5为研究对象，获得了glpR、fruA和fruB缺失突变株和互补菌株。基因glpR、fruA和fruB的缺失不影响西瓜噬酸菌的游泳运动能力和引起非寄主烟草产生过敏性坏死反应的能力。突变株ΔglpR、ΔfruA、ΔfruB利用果糖的能力、对西瓜苗的致病能力、西瓜子叶体内生长能力、种子黏附能力均显著下降且体外生长速度减慢，而抗高盐胁迫能力、抗氧胁迫能力以及抗铜离子胁迫能力显著增强。ΔglpR生物膜形成能力显著减弱，ΔfruA、ΔfruB生物膜形成能力显著增强。 3、glpR调控fruA、fruB、fruK的表达 通过qRT-PCR测定，结果显示glpR基因的缺失会使Aac5果糖利用关键基因fruA、fruB和fruK的表达量显著上调，而fruA基因的缺失会使fruB和fruK显著下调，fruB基因的缺失会使fruA和fruK显著下调。而启动子活性测定结果显示，与WT-fruBpGUS相比，ΔglpR-fruBpGUS的fruB的启动子活性显著减弱。ΔfruBp中果糖代谢相关基因fruA、fruB与fruK表达量显著下降，又因为fruA、fruB与fruK位于同一个转录单元且转录 方向一致，因而推测fruA、fruB与fruK共用同一个启动子区域。因此推测基因glpR可以通过与fruB的启动子结合，从而调控果糖代谢相关基因fruA、fruB与fruK。 4、glpR、fruA、fruB基因及果糖对致病相关基因表达量的影响 glpR、fruA、fruB在西瓜噬酸菌致病方面起关键作用：qRT-PCR测定结果显示，ΔglpR中T3SS关键基因hrpG、hrpE、hrcJ表达量较Aac5均显著下调；ΔfruA中T3SS关键基因 Aave_0449、Aave_0452、Aave_0456、Aave_0458、Aave_0459、Aave_0464、Aave_0467、Aave_0474、Aave_0476、hrpX、hrpG表达量显著下调；ΔfruB中T3SS关键基因 Aave_0448、Aave_0452、Aave_0456、Aave_0458、Aave_0459、Aave_0464、Aave_0467、Aave_0474、Aave_0476、hrpX表达量显著减少；并且果糖的存在会促进西瓜噬酸菌基因T3SS关键基因以及glpR、fruA、fruB、fruK的表达。 综上，本研究初步探究了glpR、fruA和fruB在西瓜噬酸菌Aac5致病相关表型和调控中的功能，为DeoR家族转录调控因子以及果糖磷酸转移酶系统的后续研究和寻找新的病原细菌防治靶标提供参考。
NETL