摘要
当前，由于抗生素的滥用导致抗生素耐药性日益加剧，使得抗生素的疗效受到了一定的影响，这成为了全球性的问题。因此，开发新型抗菌药物的需求变得尤为迫切。抗菌肽凭借其新颖的抗菌机制、广阔的抗菌谱、难以产生耐药性以及良好的生物安全性等特征，被视为抗菌治疗领域的新希望。本研究以抗菌肽Astucin 为模板，首先探索了它在枯草杆菌和大肠杆菌中的表达和纯化，为后续抗菌肽的使用奠定了基础，然后通过增加电荷和改变疏水性等突变方法，却没有得到活性明显提高的突变体。通过截断获得核心抗菌肽段，在此基础上构建和穿膜肽融合形成的嵌合肽，获得了抗菌活性提高的抗菌肽，并进一步筛选抗菌活性提高的嵌合肽 KLA-PENAstucin(1-23)。在嵌合肽 KLA-PENAstucin(1-23)的基础上，再通过点突变获得了抗菌活性提高的突变体KLA-PENAstucin(1-23)/19A，并对其抗菌机制进行了初探。具体研究结果如下： 1. 抗菌肽 Astucin 的表达。本研究采用枯草芽孢杆菌和大肠杆菌作为宿主，通过和标签融合方式表达。经过一系列实验条件探索，最终选用大肠杆菌进行抗菌肽的表达，经过酶切等处理，成功获得了高纯度的抗菌肽，为后续实验奠定基础。 2. 增加电荷和改变疏水性突变 Astucin。本研究采取氨基酸替换和添加氨基酸链的策略来增加抗菌肽正电荷和改变其疏水性对Astucin进行优化。实验结果表明这些方法并未显著增强Atucin的抗菌活性。 3. 嵌合肽的设计及筛选。基于理性分析和实验证实，发现 Astucin 的核心作用区域主要位于其疏水区域。为了提高抗菌效果，截短 Astucin，仅保留核心作用区域。随后，将其与多种不同穿膜肽融合形成嵌合肽，通过网站预测及实验验证，最终筛选出抗菌活力显著提高的嵌合肽KLA-PENAstucin(1-23)。 4. 嵌合抗菌肽 KLA-PENAstucin(1-23)的突变及筛选。为进一步提升 KLA-PENAstucin(1-23)的最低抑菌浓度，通过软件分析及过网站预测确定第 19 号位点的突变。通过实验验证最终得到了抗菌活性显著提高的的突变体 KLA-PENAstucin(1-23)/19A。该突变体对革兰氏阳性菌具有卓越的抑制能力，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度（MIC）分别为0.7 μM、1.4 μM和 0.7 μM。 5. 嵌合抗菌肽 KLA-PENAstucin(1-23)/19A的生物学检测及抗菌机理。本研究最终对KLA-PENAstucin(1-23)/19A进行表征，全面评估其抑菌活性与杀菌机制。研究发现，抗菌肽有广谱杀菌性，对革兰氏阳性菌效果明显。对于革兰氏阴性菌鲍曼不动杆菌，大肠杆菌和铜绿假单胞菌也展示出良好的抗菌活性，MIC分别为1.4 μM、1.4 μM 和 2.8 μM。此外，该抗菌肽表现出较低的细胞毒性和溶血性。其抗菌机理主要通过破坏细菌细胞膜完整性，从而导致细菌死亡。 综上所述，研究通过分子设计、结构优化和活性评价,成功开发了一类具有广谱抗菌活性、低细胞毒性的新型抗菌肽,为进一步深入研发具有临床应用前景的新型抗菌药物奠定了坚实基础。
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