摘要
木霉菌是国际上公认的最安全且应用最广的生物防治真菌，它不仅可诱导植物抗病性、抑制病原菌生长，还促进植物生长，是一种环保、高效的生防真菌。前期工作中从新疆喀纳斯景区土壤分离的哈茨木霉菌株T673中挖掘到一株木霉病毒Trichoderma harzianum Partitivirus 2(ThPV2),该病毒属于双分病毒科。通过利巴韦林和原生质体相结合的脱毒方法，获得了不携带病毒的菌株T673-F,对比T673和T673-F的产孢性能，ThPV2能够显著提高菌株T673产分生孢子和厚垣孢子的能力。本研究对不同生长时间段的T673和T673-F进行转录组、蛋白组、代谢组学的测序分析，对差异表达基因、蛋白、关键代谢物和代谢途径进行发掘;同时利用酵母双杂方法获得ThPV2与宿主木霉菌的互作蛋白，进而利用pull-down和BiFC进行互作蛋白的离体和活体验证;再通过基因敲除、回复和过表达法对蛋白影响产分生孢子的功能进行验证，最终解析ThPV2影响宿主T673产分生孢子的内在机制，研究结果如下: 1.转录组学分析共获得了 45个差异显著表达基因，推测其中与木霉菌产孢相关的基因主要有:Zn2Cys6型转录因子相关基因、过氧化物酶相关基因、细胞色素P450家族相关基因、菌体自噬相关基因、MAPK signaling pathway相关基因、与NAD和NADPH转化相关的基因。蛋白组学分析共获得了 28个差异显著蛋白，推测其中与木霉菌产孢相关的蛋白主要有细胞色素P450家族蛋白、抗氧化功能相关蛋白、NADH脱氢酶、协助转运的突触囊泡转运体及相关转运体蛋白、核糖体相关蛋白、磷酸代谢相关蛋白。代谢组学分析获得了 55种差异显著代谢物，推测与产分生孢子有关的代谢物主要富集于甘油磷脂代谢、脂代谢、氨基糖和核苷糖代谢途径、ABC转运蛋白途径、嘌呤代谢、泛酸和辅酶A生物合成，以及一些氨基酸的生物合成与代谢途径。依据组学联合分析，推测木霉病毒ThPV2的存在主要影响了糖酵解过程、氧化磷酸化、蛋白转运过程、氨基糖与核苷酸糖代谢、葡萄糖利用以及一些氨基酸代谢来调节T673产分生孢子。 2.利用酵母双杂，筛选到与木霉病毒核酸复制酶(RdRP)和外壳蛋白(CP)均互作的候选蛋白有10个、与RdRP互作的候选蛋白有34个、与CP互作的候选蛋白有2个。其中与RdRP和 CP 均互作的蛋白有注释的有 4 个: Xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase A、NADH kinase pos5、COP9 signalosome complex subunit 5、Clathrin light chain。与 RdRP 互作且有功能注释的蛋白有 17 个:SNF2 family、Aminotransferase、Beta-glucosidase、Subtilase family、VIB-1、Bud site selection protein(BUD4)、Survival factor 1、Replication factor A protein 2、ATP 合成酶亚基、Putative hydroxymethylpyrimidine、Putative fungistatic metabolite、Chromosome segregation protein sudA、Heat shock 70 kDa protein、Mitochondrial protein import protein mas5、Transport protein particle subunit trs120。与 CP 互作且有功能注释的蛋白有 2 个:Oxysterol-binding protein-like protein 1、Nucleoporin pom152。将酵母体系筛库得到的蛋白基因与组学进行联合分析，推测转录因子VIB-1、COP9信号复合体5和SUN family是ThPV2影响木霉菌T673产分生孢子的重要调节因子，其中只有转录因子VIB-1在转录组、蛋白组和酵母双杂中均为可关联的蛋白。 3.成功构建VIB-1敲除株、回复株和过表达株，通过对野生菌株、VIB-1敲除株、VIB-1回复株和VIB-1过表达株产孢性能的比较，发现转录因子VIB-1与ThPV2互作显著影响木霉菌T673的产分生孢子的量。Pull down实验和BiFC实验结果表明ThPV2-RdRP与VIB-1具有很强的离体和活体互作关系。VIB-1基因敲除株的产孢量比野生型菌株降低了 36.68％,达极显著水平;过表达株产孢量最高，但与回复株和野生型菌株均无显著差异。推测ThPV2的存在导致宿主VIB-1与ThPV2-RdRP互作，正向调控T673产分生孢子量和正向调控ThPV2-RdRP的转录与合成;此外结合组学分析和酵母双杂发现ThPV2-RdRP与Trs120（转运蛋白）、β-葡萄糖苷酶（SUN family）（分生孢子形态建成）互作，以及ThPV2-RdRP和CP都与COP9信号复合体5（分生孢子形态建成）互作，而这些蛋白功能涉及到蛋白转运、脂代谢、氨基糖和核苷糖代谢等途径，均与分生孢子产生所需要的代谢途径相关。
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