摘要
目前，防治害虫主要依赖各类杀虫剂，过度使用杀虫剂极易引起害虫抗药性的发生。而害虫抗药性的发生往往伴随着生长迟缓、生殖能力降低和生存能力减弱等显著的适合度代价，这些代价可以在一定程度上限制害虫在田间对杀虫剂的抗性发展。然而，有些害虫却能在不影响生长发育的前提下对杀虫剂产生完美的高抗性，这对杀虫剂的有效利用构成严重威胁。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)能够产生多种杀虫晶体蛋白，基于这些杀虫晶体蛋白研发的Bt生物杀虫剂和转Bt基因抗虫作物能高效、特异的杀死多种农业害虫。小菜蛾(Plutella xylostella)是世界上第一个在田间对Bt生物杀虫剂产生高抗性的农业害虫，目前发现它对Bt Cry1Ac杀虫蛋白产生高抗性的同时不具有明显的适合度代价。因此，小菜蛾是研究害虫对杀虫剂产生高抗性的同时不具有明显适合度代价的理想实验材料。 本实验室前期研究发现，保幼激素(Juvenile hormone,JH)含量升高是弥补小菜蛾Bt Cry1Ac抗性适合度代价的主要原因。然而，介导Bt Cry1Ac抗性小菜蛾体内JH含量升高的机制仍不清楚。本研究结果表明，Bt Cry1Ac抗性小菜蛾中肠组织中的m6A(N6-methyladenosine)修饰水平显著升高，进一步研究发现m6A水平的升高源于中肠组织中两个关键的甲基转移酶亚基PxMettl3和PxMettl14水平的升高，并且发现PxMettl3和PxMettl14通过介导m6A修饰抑制昆虫保幼激素酯酶(Juvenile hormone esterase,JHE)的表达，从而调控Bt Cry1Ac抗性小菜蛾中JH水平的升高，最终导致小菜蛾在对Bt Cry1Ac杀虫蛋白产生抗性的同时不影响正常生长发育。主要研究内容和结论如下: 1.Bt Cry1Ac抗性小菜蛾中肠组织中m6A修饰水平显著升高 本研究首先利用斑点杂交(Dot blot)和高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)实验检测小菜蛾Bt Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S、Bt Cry1Ac毒素诱导种群Cry1Ac-48h和Bt Cry1Ac抗性种群NIL-R(抗性倍数约为5000倍)中肠组织的RNA修饰水平。研究发现只有m6A修饰水平在Cry1Ac-48h和NIL-R种群的中肠组织中显著升高。 2.鉴定到的PxJHE基因调控JH含量影响小菜蛾适合度代价 通过MeRIP-seq和RNA-seq联合分析，鉴定到被注释为小菜蛾保幼激素酯酶(PxJHE)的基因，并利用体外代谢实验证明PxJHE具有代谢JH的生理功能。利用实时荧光定量PCR(qPCR)和western blot实验验证了 PxJHE基因的表达水平在抗性种群中肠组织中显著降低。利用siRNA(small interfering RNA)干扰技术在DBM1Ac-S种群中沉默PxJHE基因后，发现JH含量显著升高，蛹的尺寸明显变大，且其它生物学参数也发生了显著的变化。 3.m6A修饰负调控PxJHE的表达 利用m6A-IP-qPCR技术确定PxJHE的3''-UTR(3''-Untranslated Region)区且靠近终止密码子处存在一个m6A修饰位点，且发现m6A修饰水平在NIL-R种群的中肠组织中显著高表达。利用双荧光素酶报告实验(Dual-luciferase reporter assays)和 mRNA 稳定性实验(mRNA stability assay)证明了此m6A位点负调控PxJHE基因表达。 4.PxMettl3和PxMettl14通过介导PxJHE基因表达调控JH含量影响小菜蛾适合度代价 实验室前期研究发现两个关键的m6A修饰甲基转移酶亚基PxMETTL3和PxMETTL14的表达水平在NIL-R种群的中肠组织中显著升高。利用siRNA干扰技术将PxMettl3和PxMettl14基因在NIL-R种群中沉默，发现PxJHE基因的m6A水平显著降低，但表达水平显著升高，UPLC-MS/MS检测到JH含量显著下调，生物学检测发现幼虫死亡率小幅度升高，且适合度的各项生理学指标(化蛹率、羽化率、蛹重、蛹期、产卵期、繁殖力、孵化率和成虫寿命)都显著下降。表明PxMettl3和PxMettl14基因通过调控JH含量影响小菜蛾的适合度代价。 5.m6A修饰位点的体内功能验证 为了在小菜蛾体内验证PxJHE基因的m6A位点的功能，本研究利用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复(Homologous-directed repair,HDR)途径在小菜蛾NIL-R种群中构建了 m6A位点的特异性突变的m6A-KO种群。与DBM1Ac-S和NIL-R种群相比，m6A-KO种群的JH含量显著降低，蛹的尺寸明显变小，且出现了严重的适合度代价。 总之，本研究发现两个关键的m6A甲基转移酶基因PxMettl3和PxMettl14表达水平升高促进了PxJHE基因的m6A水平增加，从而抑制了PxJHE基因的表达，进而诱导小菜蛾体内JH含量显著升高，使小菜蛾对Bt Cry1Ac产生高抗性的同时维持正常的生长发育。本研究解析了 m6A修饰介导的昆虫权衡杀虫剂抗性与生长发育的表观遗传学分子机制，并为农业害虫的防治提供新的理论依据。
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