摘要
粗毛纤孔菌 (Inonotus hispidus)在我国医药领域有着悠久的历史，是传统中药“桑黄”的正源。粗毛纤孔菌主要含有多糖类、多酚类、甾类等化学成分，并具有多种药理活性。本文以古籍《本草蒙筌》记载“散血如神，止血甚捷”为导向，探究中药桑黄，即粗毛纤孔菌的止血作用及其作用机制。 具体研究成果如下： 1、粗毛纤孔菌子实体及其不同极性溶剂提取物止血活性: 利用小鼠断尾模型测定小鼠出血时间、眼内眦采血法测定凝血时间、凝血功能指标、血小板参数和红细胞参数，评估粗毛纤孔菌子实体及不同极性提取物的止血活性。结果表明，粗毛纤孔菌子实体粗粉、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和水提取物对小鼠均有不同程度止血功效，其中粗粉效果最好。 2、粗毛纤孔菌止血有效物质的提取分离与鉴定: 采用酸碱法从粗毛纤孔菌子实体粉末中提取的样品，经傅里叶红外光谱(FT-IR)鉴定为甲壳素，固态核磁共振 (13C CP MAS NMR)和 X射线对样品进行验证。结果显示，核磁共振光谱在 δ75.21 (C5)和 73.29 (C3) ppm 处有两个特殊的特征峰，C3和C5合并成一个峰；X射线表明在9.7°、19.2°、28°、30°、37.3°有信号峰，与报道中α-甲壳素标准品有相同的特征峰，证明提取的样品为α-甲壳素。柱层析法从石油醚部位提取的样品与麦角甾醇标准品对照，通过高效液相进行定性分析。HPLC图谱结果显示，对照品的保留时间为 21.4 min，样品的保留时间为 21.1 min，表明粗毛纤孔菌石油醚提取物中分离的物质为麦角甾醇。 3、粗毛纤孔菌止血有效物质对小鼠体内止血作用及其机制研究: 选择小鼠肝脏划痕模型检测小鼠肝脏出血时间，眼眶采血检测血浆复钙时间、凝血四项、凝血因子及血小板参数；ELISA 检测小鼠血浆中 TXB2 、6 - Keto-PGFIα、t-PA 、PAI-1 和 Western Blot检测 AKT/PI3K相关通路。结果显示，粗毛纤孔菌止血有效物质 (甲壳素、麦角甾醇和联合给药组) 均显著缩短小鼠肝脏出血时间和血浆复钙时间；通过激活AKT/PI3K信号通路，调节PT、APTT、TT、FIB、凝血因子 VⅢ、X、XⅡ和 t-PA、PAI-1、TXB2 、6 - Keto-PGFIα含量实现快速止血。 4、粗毛纤孔菌止血有效物质对H2O2诱导HUVCES细胞损伤的保护作用: 体外建立 H2O2诱导人脐静脉内皮细胞 (HUVCES)损伤模型，探讨甲壳素、麦角甾醇和联合给药改善氧化应激引起的HUVCES 细胞损伤。结果表明， CCK-8法检测细胞 IC50的浓度为 800 μmol/L，此为最佳造模浓度；甲壳素、麦角甾醇和联合给药最佳治疗浓度分别为 400、500、200 μmol/L。通过 ELISA检测细胞上清液相关指标、Western Blot和 q RT-PCR对 Caspase-3、Bax和 Bcl-2相关蛋白进行验证。结果显示，甲壳素、麦角甾醇和联合给药通过下调Caspase-3、Bax 蛋白，上调 Bcl-2 蛋白表达，细胞上清液中 MDA、ROS显著下降，SOD、GSH-PX、CAT和NO明显上升从而清除自由基，缓解氧化应激造成的HUVCES细胞损伤，降低细胞凋亡率。 5、粗毛纤孔菌止血有效物质复方液体创可贴的制备与抑菌性能: 通过成膜时间确定甲壳素、麦角甾醇和联合给药复方液体创可贴最佳比例，并测其防水性能、抗干燥性能和抑菌性能。结果显示，甲壳素和联合给药复方液体基质与CMC基质在1∶1的比例下成膜时间最短，麦角甾醇复方液体基质与CMC基质在1∶3和1∶1情况下成膜时间相差不大，但在1∶1比例下成膜时间相对会更短；有良好的防水性能、抗干燥性、对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有显著的抑菌作用。 综上所述，体内和体外实验结果均表明，粗毛纤孔菌具有显著的止血功效；且主要活性成分为甲壳素和麦角甾醇。本研究从全新的角度对粗毛纤孔菌的止血活性物质基础和止血机制进行了探索，从而为之后其他菌物药的止血研究奠定了基础。
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