摘要
烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV)等RNA病毒引起的烟草病毒病分布广泛，危害烟叶的产量和品质，给烟叶生产带来严重损失。CRISPR-Cas13是一类新发现的RNA编辑系统，可以靶向干扰RNA,具有效率高、特异性强、可编程的特点。将CRISPR-Cas13编辑系统导入植物，利用特异的靶点降低RNA病毒的复制或毒性是一种可行的提高植物对RNA病毒抗性的方法。本研究构建了可以表达Cas13a、CasRx、Cas13x 的 CRISPR-Cas13 载体，比较了 3 个 CRISPR-Cas13 载体的 RNA 编辑效率;针对TMV、CMV的保守区段设计gRNA,并比较不同gRNA对病毒的沉默效率;进一步创制稳定表达CRISPR-Cas13编辑载体的转基因烟草材料，对其进行抗性鉴定。主要研究结果如下: 1.从已发表文献中挖掘获得Cas13a、CasRx、Cas13x基因序列，并对其进行烟草密码子偏好性优化;以pORE载体为骨架，AtU6-26启动子启动表达gRNA,CaMV 35S启动子启动表达Cas13蛋白，构建了 3个CRISPR-Cas13编辑载体。 2.利用侵染性克隆载体35S∷TMV-GFP评估比较CRISPR-Cas13系统不同蛋白在植物中对靶RNA的沉默效率。结果显示，Cas13x的抑制效果最好，CasRx的抑制效果次之，Cas13a的抑制效果相比于前两者略差。 3.从52个TMV病毒株系基因组序列中鉴定到保守区段8个，根据候选区段信息及CasRx和Cas13x对gRNA的要求设计gRNA,并确保gRNA对病毒具备优良特异性，最终设计出7个gRNA。通过瞬时侵染本氏烟比较各gRNA编辑TMV的效率，发现CasRx-TMV5和Cas13x-TMV5均表现出较高抑制效率，分别为85％和90％。 4.在分析比对259个不同株系CMV的RNA 1序列，266个RNA 2序列及250个RNA 3序列后，设计出5个gRNA。通过比较各gRNA编辑CMV-SD的效率，发现CasRx-CMV4和Cas13x-CMV4均表现出较高的沉默效率，与对照组相比，其病毒含量几乎为零。同时，CasRx-CMV4和Cas13x-CMV4对CMV-Fny也具有较好抑制作用，在注射叶中对CMV的抑制率为78％左右，在系统叶中对CMV的抑制率分别为80％和45％。 5.利用叶盘法创制了稳定表达CRISPR-Cas13编辑载体的烟草材料，并对获得的转基因株系进行病毒病抗性鉴定。发现接种TMV7d后，与K326相比，CasRx转基因株系对TMV抑制效率为38％～73％,Cas13x转基因株系为43％～79％。其中，CasRx-TMV5#1、#12的抑制效率为70％～80％,Cas13x-TMV5#16 约为 80％。接种 CMV 7 d 后，与 K326 相比，CasRx 转基因株系对CMV抑制率为42％～95％，Cas13x转基因株系为29％～97％,多个株系对CMV的抑制率都在90％左右;接种15 d后，K326出现CMV症状，而CasRx和Cas13x转基因株系未观察到病害症状。 综上所述，本研究构建了完整表达Cas13a、CasRx、Cas13x及其对应crRNA的CRISPR-Cas13载体，比较了 Cas13a、CasRx和Cas13x的编辑效率;针对TMV、CMV的保守区段设计了靶向病毒基因组的特异gRNA,筛选得到了对病毒有较高沉默效率的靶点;创制了 TMV和CMV抗性提高的转基因烟草植株，为植物RNA病毒的防治提供新的思路和策略。
NETL