摘要
目的:探究加味柴胡疏肝汤通过受体相关蛋白1/受体相关蛋白3/假激酶混合谱系激酶结构域样蛋白(RIP1/RIP3/MLKL)信号通路对癫痫小鼠的调控作用。探讨加味柴胡疏肝汤在分子水平作用机制，为今后癫痫的临床防治提供新的思路。 方法:采用随机数字表法将60只KM小鼠分为正常组、模型组、加味柴胡疏肝汤低剂量组、加味柴胡疏肝汤中剂量组、加味柴胡疏肝汤高剂量组、卡马西平组。采用盐酸匹罗卡品制备癫痫模型，予加味柴胡疏肝汤 19.52g/(kg·d)、39.04g/(kg·d)、78.08g/(kg·d)、卡马西平 30mg/(kg·d)，连续灌胃两周，观察小鼠一般情况、脑电波情况、苏木素-伊红(HE)染色观察病理形态学改变、原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测神经细胞凋亡率、实时定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)及蛋白质印迹(Western Blot)检测小鼠海马组织RIP1、RIP3、MLKL、TNF-α、IL-1β、IL-6 的 mRNA和蛋白的表达水平。 结果:1 癫痫发作情况:模型组小鼠在注射匹罗卡品之后，开始出现异常，出现不同程度的癫痫发作，其中4只死于全身性强直阵挛性癫痫发作，其余小鼠均出现癫痫大发作。 2 一般情况:正常组小鼠形体较大，精神状态佳进食饮水正常。造模后小鼠形体瘦小，体重较正常组减轻，精神差，饮食饮水减少。药物治疗组治疗两周后，与模型组相比，小鼠精神状态有所改善，进食进水略有增加，体重也略增加，其中卡马西平组状态最佳，但一般情况并未达到正常组的水平，各治疗组之间的体重也没有明显差异。 3 脑电图情况:与正常组小鼠脑电图相比，模型组小鼠脑电图可以明显观测到连续发作的痫样波。其余组与模型组相比，脑电波痫性放电频次及强度明显减少，其中卡马西平组最明显。 4 HE染色:正常组和卡马西平组小鼠神经元形态规则，排列整齐密集，均未见明显异常。模型组和加味柴胡疏肝汤低剂量组可见较多神经元固缩，细胞体积减小，形态呈不规则状，胞核、胞质分界不清，染色加深。加味柴胡中剂量组及加味柴胡疏肝汤高剂量组，偶见神经元固缩，细胞体积减小，形态不规则，胞核、胞质分界不清，染色加深。 5 TUNEL法:与正常组相比，模型组、加味柴胡疏肝汤低中高剂量组、卡马西平组海马组织凋亡细胞阳性率明显增高，P＜0.05。与模型组相比，加味柴胡疏肝汤中剂量、加味柴胡疏肝汤高剂量组、卡马西平组凋亡细胞阳性率降低，P＜0.05。 6 qRT-PCR结果:模型组、加味柴胡疏肝汤低剂量组、加味柴胡疏肝汤中剂量组的RIP1、RIP3、MLKL的mRNA相对表达量明显高于正常组，P＜0.05,其中表达量最高的为模型组。与模型组相比，加味柴胡疏肝汤中剂量组、加味柴胡疏肝汤高剂量组、卡马西平组的RIP1、RIP3、MLKL的mRNA的相对表达量明显降低，P＜0.05。加味柴胡疏肝汤低剂量组的RIP3、MLKL的mRNA的相对表达量明显低于模型组，P＜0.05。模型组、加味柴胡疏肝汤低剂量组的TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA相对表达量明显高于正常组，P＜0.05。加味柴胡疏肝汤中剂量组的IL-1β、IL-6的mRNA相对表达量明显高于正常组，P＜0.05。与模型组比，加味柴胡舒肝汤高剂量组、卡马西平组的TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA相对表达量减少，P＜0.05。加味柴胡疏肝汤中剂量组的IL-1β、IL-6的mRNA相对表达量明显低于模型组。加味柴胡疏肝汤低剂量组的IL-1β的mRNA相对表达量明显低于模型组，P＜0.05。 7 WB结果:与正常组相比，模型组、加味柴胡疏肝汤低剂量组、加味柴胡疏肝汤中剂量组的RIP1、RIP3、MLKL蛋白的相对表达量升高，P＜0.05,其中三个目的蛋白表达量最高的模型组。加味柴胡疏肝汤高剂量组、卡马西平组的RIP1、RIP3、MLKL蛋白的相对表达量明显低于模型组，P＜0.05。加味柴胡疏肝汤低剂量组、加味柴胡疏肝汤中剂量组的RIP1蛋白的相对表达量明显低于模型组，P＜0.05。模型组、加味柴胡疏肝汤低剂量组TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白相对表达量明显高于正常组，P＜0.05,其中模型组这三个目的蛋白的表达量最高。同时加味柴胡疏肝汤中剂量组TNF-α、IL-6的蛋白相对表达量也明显高于正常组，P＜0.05。与模型组比，加味柴胡疏肝汤高剂量组、卡马西平组TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白相对表达量明显减少，P＜0.05，其中卡马西平组最为明显。同时，加味柴胡疏肝汤中剂量组IL-1β蛋白相对表达量明显低于模型组，P＜0.05。 结论:1 癫痫发作时RIP1/RIP3/MLKL坏死性凋亡信号通路被激活，引起炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的异常表达，导致癫痫小鼠海马组织凋亡细胞阳性率增加，参与癫痫的发病过程。 2 加味柴胡疏肝汤可能通过拮抗RIP1/RIP3/MLKL信号通路的激活，从而抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的过表达，降低癫痫小鼠海马组织凋亡细胞阳性率，抑制癫痫小鼠的坏死性凋亡，从而起到抗癫痫的作用。
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