摘要
目的:由多因素导致的骨关节炎是骨科领域最高发的一种慢性进行性疾病，它的特点为关节软骨退变与软骨下硬化，经常累及负重大和活动多的膝关节、髋关节和脊柱等部位。全球65岁以上人群超过一半为骨关节炎患者，严重危害中老年人群健康。研究发现，活性氧引起的氧化应激是导致软骨细胞炎症损伤的主要原因。橙皮素是一种常见的天然黄烷酮聚糖，具有抗氧化作用、抗炎作用、抗肿瘤作用和心血管保护作用等一系列重要生物功能。橙皮素可以通过多种机制或者信号通路对软骨细胞产生保护作用，但其保护机制尚未完全阐明。因此，该实验旨在探索橙皮素是否可以通过抑制活性氧介导之氧化应激减轻骨关节炎模型软骨细胞炎症与软骨退变。 方法:(1)在体外采集、培养SD乳鼠双侧膝关节的软骨细胞，采用番红O染色进行软骨细胞鉴定。(2)通过MTT法检测不同浓度(0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8μM)的橙皮素对软骨细胞的细胞毒性，以确定橙皮素最佳的工作浓度。(3)将软骨细胞随机分为3组:对照组、模型组和实验组，对照组用DMEM培养液培养细胞，模型组和实验组采用脂多糖诱导软骨细胞建立骨关节炎模型，实验组造模后给予橙皮素干预24 h。(4)将第3代软骨细胞接种到24孔板中（2×104个/孔），按上述软骨细胞分组和处理后，采用Calcein-AM/EthD-Ⅰ染色检测软骨细胞活性。(5)将第3代软骨细胞接种到6孔板中（2×105个/孔），按上述软骨细胞分组和处理后，软骨特异性Ⅱ型胶原通过免疫组化检测。(6)将第3代软骨细胞接种到6孔板中（2×105个/孔），按上述软骨细胞分组和处理后，细胞内活性氧通过活性氧检测试剂盒检测。(7)将第3代软骨细胞接种到6孔板中（2×105个/孔），按上述软骨细胞分组和处理后，采用ELISA检测抗氧化剂总谷胱甘肽水平，(8)将第3代软骨细胞接种到6孔板中（2×105个/孔），按上述软骨细胞分组和处理后，采用qRT-PCR检测炎症基因肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6与软骨特异性基因Ⅱ型胶原的表达。 结果:（1）番红O染色后碱性染料与细胞蛋白多糖结合，使细胞变为红色，细胞具有分泌蛋白多糖的功能，表明提取的细胞为软骨细胞;(2)MTT法细胞毒性实验结果表明，与对照组（橙皮素浓度为0 μ M）相比，橙皮素在0.125 μM-2.0 μM的浓度范围内对软骨细胞没有显著的细胞毒性。当浓度为0.5 μM时，软骨细胞活力最佳。然而，当橙皮素浓度为2.0 μM-8.0 μM时，软骨细胞的活力呈下降趋势。因此，0.5 μM被认为是干预骨关节炎软骨细胞的橙皮素最佳浓度，并选择此浓度为橙皮素的工作浓度;（3）Calcein-AM/EthD-Ⅰ染色检测橙皮素对软骨细胞活力的影响结果表明，与对照组（橙皮素浓度为0 μM）相比，模型组死细胞增多、活细胞减少（P＜0.05）。与模型组相比，实验组活细胞增多、死细胞减少（P＜0.05）。说明橙皮素可以减轻脂多糖对体外培养的骨关节炎软骨细胞生长抑制作用。（4）Ⅱ型胶原免疫组化检测表明，与对照组（橙皮素浓度为0 μM）相比，模型组软骨细胞的Ⅱ型胶原阳性染色明显减少（P＜0.05);然而橙皮素干预的实验组软骨细胞的Ⅱ型胶原阳性染色较模型组增加(P＜0.05)。(5)DCFH-DA检测软骨细胞内活性氧水平结果表明，与对照组(橙皮素浓度为0 μ M)比较，模型组软骨细胞内活性氧水平显著升高(P＜0.05);而橙皮素干预的实验组软骨细胞内活性氧水平较模型组降低(P＜0.05)。(6)ELISA检测软骨细胞总谷胱甘肽水平结果显示，与对照组(橙皮素浓度为0 μM)相比，模型组软骨细胞的总谷胱甘肽水平显著降低(P＜0.05),而实验组软骨细胞的总谷胱甘肽水平较模型组升高(P＜0.05),表明橙皮素抑制了脂多糖诱导骨关节炎软骨细胞的氧化应激。(7)qRT-PCR检测显示，与对照组(橙皮素浓度为0 μ M)相比，模型组软骨细胞的肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6和基因表达均显著升高，Ⅱ型胶原基因表达降低(P＜0.05);与模型组比较，实验组软骨细胞的肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6基因表达均明显降低，Ⅱ型胶原基因表达升高(P＜0.05)。 结论:(1)橙皮素可以减轻脂多糖对体外建立的骨关节炎模型软骨细胞生长抑制作用。(2)橙皮素能够减少脂多糖诱导的软骨细胞内ROS水平和提高软骨细胞抗氧化能力。(3)橙皮素能够减少脂多糖诱导的软骨细胞特异性Ⅱ型胶原降解。(4)橙皮素能够减少脂多糖诱导的软骨细胞炎症基因(白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α基因)表达水平和增加软骨特异性Ⅱ型胶原基因表达水平。(5)橙皮素对脂多糖诱导的骨关节炎软骨细胞炎性退变具有保护作用的机制可能与橙皮素抑制活性氧介导的氧化应激有关。
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