摘要
目的:卵巢早衰(Premature Ovarian Failure，POF)不仅是严重的生殖内分泌疾病，更是影响生殖健康的社会问题。本研究基于网络药理学方法和分子实验，旨在探索蒲公英方提取物对卵巢早衰的保护作用及其相关机制。 方法:首先通过文献及中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)等收集蒲公英方活性成分，通过Swiss Target Prediction等数据库收集蒲公英方活性成分对应靶点。从GeneCards等数据库中使用检索词“Premature ovarian failure”收集卵巢早衰对应靶点。将蒲公英方对应靶点与卵巢早衰对应靶点取交集，得到药物-疾病共有靶点。导入String数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)网络并筛选核心靶点进行可视化。通过Cytoscape、DAVID和KOBAS网站进行核心靶点的基因本体(Gene Ontology，GO)功能分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。再应用SYBYL软件对有效活性成分及核心靶点进行分子对接。 其次通过不同浓度过氧化氢(Hydrogen Peroxide，H2O2)溶液(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mmol/L)刺激人卵巢颗粒细胞SVOG建立氧化应激模型。CCK-8法检测不同作用时间周期下SVOG细胞活性，并通过活细胞动态分析系统对造模条件进行双重验证。通过蒲公英方提取物Shawkea DE-T1(DE-T1)干预模型组SVOG细胞，CCK-8法检测DE-T1干预效果。检测各组细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)、脂质过氧化物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和总谷胱甘肽的变化;通过流式细胞仪检测细胞周期与细胞凋亡情况;采用JC-1法检测线粒体膜电位变化;通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测IL-6R、IL-17、HIF-1α、STAT3、VEGF、LHR和FSHR基因的mRNA表达量。 然后通过体外培养新生小鼠卵巢组织观察DE-T1对卵泡激活的影响。将25只新生雌性C57BL/6小鼠解剖，于体式显微镜下分离出卵巢。随机分为基础培养基组、小分子激活剂组、10％(v/v)DE-T1组和10％(v/v)DE-T1联合小分子激活剂组，每组约4-6个卵巢，放入细胞培养小室中进行培养，培养48小时后，更换为基础培养基再培养5天。第7天收集所有小鼠卵巢，于显微镜下观察并进行HE染色。随后选择25只18月龄自然衰老C57BL/6小鼠，随机分为空白对照组、DE-T1自由饮组(20/100/200/1000倍浓度)，每组5只。12周后解剖取卵巢组织，行HE染色，观察DE-T1对自然衰老小鼠卵巢组织的影响。最后将8周龄雌性C57BL/6小鼠15只，随机分为正常对照组、模型组和DE-T1组，每组5只。模型组和DE-T1组每天行腹腔注射环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)制作卵巢早衰模型;DE-T1组同时给予0.2mL DE-T1溶液灌胃干预(浓度为7.75mg/mL);正常对照组和模型组则给予同体积生理盐水。21天后处死，观察各组小鼠卵巢组织形态学和卵泡数量以及血浆中激素水平变化。 结果:本研究共检索得蒲公英方活性成分97种，相应靶点617个;卵巢早衰疾病相关靶点1156个，药物-疾病共有靶点189个，根据PPI图中各靶点间的相关度值筛选出相互作用关系最强的30个靶点作为蒲公英方治疗卵巢早衰的关键靶点。GO功能分析提示，蒲公英方治疗卵巢早衰主要与细胞缺氧和细胞凋亡等生物学过程相关;KEGG通路富集分析结果显示，蒲公英方治疗卵巢早衰的机制主要涉及PI3K/AKT、HIF-1α和IL-17等信号通路。 其次CCK-8检测结果显示H2O2抑制卵巢颗粒细胞SVOG增殖活力，且呈浓度-时间依赖性。H2O2浓度为0.6mmol/L作用4h时，抑制率（47.7±2.5％）最接近细胞半数抑制率（IC50），与活细胞动态分析系统检测的细胞融合度降低情况相符合。与空白组相比，模型组细胞内ROS和MDA含量显著增加，总谷胱甘肽含量明显减少，细胞周期阻滞在S期的比例升高，细胞早期凋亡与晚期凋亡的比例均显著升高，细胞线粒体膜电位明显降低，结果均具有统计学差异（P＜0.05）。20和40mg/L DE-T1溶液干预氧化应激SVOG细胞模型后，其细胞活力显著上升，细胞内ROS和MDA含量显著下降，总谷胱甘肽含量显著升高，细胞停滞在G1和S期的比例明显减少，细胞凋亡率显著降低，细胞线粒体膜电位以及JC-1Red/Green比例明显升高，结果均具有统计学差异（P＜0.05）。与空白组相比，模型组细胞中IL-17、IL-6R、STAT3、HIF-1α和VEGF的mRNA表达水平显著升高（P＜0.01），FSHR和LHR的mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）。20和40mg/L DE-T1干预后，IL-17、IL-6R、STAT3和VEGF mRNA的表达水平显著下降（P＜0.05）FSHR和LHR的mRNA表达水平上升（P＜0.05）。对于HIF-1α的mRNA表达水平，20mg/L DE-T1组显著下调（P＜0.05）而40mg/L DE-T1组下调不明显（P=0.129）。 与基础培养基相比，DE-T1组体外培养卵巢可见原始卵泡数及总卵泡数明显增加（P＜0.01）。自然衰老小鼠经过DE-T1自由饮，其生长卵泡数和总卵泡数显著增高（P＜0.05）。与正常对照组相比，模型组小鼠血清AMH水平显著降低、卵巢间质细胞水肿程度明显，皮质中闭锁卵泡比率明显增高（P＜0.05）。DE-T1干预后小鼠血清AMH水平显著升高、间质细胞水肿减轻，卵巢中生长卵泡率增多且闭锁卵泡率显著降低（P＜0.05）。 结论:（1）网络药理学研究发现蒲公英方治疗卵巢早衰与细胞缺氧和细胞凋亡等生物学过程以及STAT3/HIF-1α/VEGF等信号通路有关。 （2）蒲公英方提取物DE-T1能增强人卵巢颗粒细胞SVOG细胞的抗氧化能力、抑制细胞凋亡并提高其对激素受体的感应性，与STAT3/HIF-1α/VEGF信号通路相关。 （3）蒲公英方提取物DE-T1通过改善小鼠血清激素水平、缓解细胞水肿情况以及增加各级卵泡数，从而改善卵巢的生物学功能。
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