摘要
目的：DNA拓扑异构酶（Topo）是抗癌药物重要的靶点，然而临床上作用于Topo的药物均为单一靶点Topo抑制剂，且存在稳定性差、耐药性、副作用大等缺点。为了寻找新型、高效、副作用少的Topo双重抑制剂，设计合成咔唑芳酰腙衍生物，评估其生物活性，并在此基础上系统地研究其作用机制，为开发新型Topo双重抑制剂提供理论基础和实验支撑。 方法：采用药效团杂交策略，将咔唑母核和取代酰肼整合为一个化合物骨架，在此基础上，改变咔唑环N位烷基链的长度，并在酰肼基团末端引入芳杂环取代基团，合成咔唑芳酰腙衍生物；利用FT-IR、1H NMR、13C NMR、NOESY和HRMS等表征方法对合成的衍生物进行结构表征；采用CCK-8法检测衍生物对人HeLa宫颈癌细胞、Aspc-1胰腺癌细胞、HepG2肝癌细胞和正常MCF-10A乳腺上皮细胞的体外抗增殖活性；基于活性测试结果，建立构效关系；采用流式细胞术检测目标衍生物对癌细胞的凋亡诱导作用及周期分布影响；采用琼脂糖凝胶电泳检测化合物对TopoⅠ和Ⅱ活性抑制作用；使用AutoDock Vina软件对化合物与Topo晶体结构进行对接模拟，运用PyMOL软件将对接结果可视化分析；使用Gaussian软件，密度泛函理论（DFT）计算化合物反应性参数；采用ADMETLab程序计算化合物理化和药代动力学参数。 结果：（1）设计合成两个系列共18个咔唑芳酰腙衍生物（5a-5i，6a-6i），经检索其中13个为未见报道的化合物，并成功运用多种表征手段进行结构表征。（2）体外抗增殖活性实验表明，所测试的化合物对三种癌细胞增殖均有强烈的抑制作用，IC50值为0.52~2.95μM，显著优于两种阳性对照药物羟喜树碱和依托泊苷（IC50∶1.35~98.6μM）。其中，6f被认为最有效的化合物，对三种癌细胞的IC50值为0.52~0.71μM，均达到了纳摩尔级别，且对正常细胞系毒性较低，IC50值为102μM。（3）构效关系研究表明，化合物咔唑环N-9位为丁基取代时活性要优于乙基取代，同时酰腙末端芳杂环上存在吸电子基时活性显著增强；不同芳杂环取代时对活性影响从高到底依次为三氟甲基苯、噻唑、溴呋喃、溴吡啶、吲哚、呋喃、吡唑、吡啶、噻吩。（4）流式分析结果表明，在化合物浓度为0~1.8μM时，6f对HeLa的凋亡率由6.18%增加到23.43%，呈浓度依赖性地诱导细胞凋亡。同浓度下G0/G1期细胞比例由61.1%增加到69.8%，S期细胞占比显著减少，表明化合物能将细胞阻滞于G0/G1期。（5）琼脂糖凝胶电泳结果表明化合物6f对TopoⅠ和Ⅱ介导的DNA松弛反应具有双重抑制作用，且呈浓度依赖性，优于羟喜树碱和依托泊苷。（6）分子对接结果表明，化合物6f能与TopoⅠ和TopoⅡ产生较高的结合能，并能嵌入到复合物碱基对之间，与产生活性相关的残基建立相互作用。DFT计算一系列指数与对接模拟及实验结果具有一致性。最后目标衍生物类药性与ADME/T性质预测结果显示，化合物均符合Lipinski规则。且衍生物在肠道中都具有较高的吸收率，化合物对Caco2和MDCK细胞有良好的渗透性，较低的BBB透过率。此外，化合物6f对小鼠具有较低的毒性。 结论：本文采用药效团杂交策略设计合成了两个系列共18个咔唑芳酰腙衍生物。活性研究表明这类衍生物对多种癌细胞系具有较强的抗增殖作用，且部分衍生物对正常细胞毒性较低。流式细胞术结果表明目标衍生物（6f）通过诱导癌细胞凋亡并阻滞周期进程来抑制细胞增殖。进一步机制研究表明6f在一定浓度下对TopoⅠ和Ⅱ具有双重抑制作用，对接模拟和理论计算进一步补充其作用机制。推测6f通过抑制Topo来阻断细胞的周期连接过程，产生DNA单链或双链断裂，进一步损害基因组的完整性并导致细胞凋亡。最后ADME/T分析目标衍生物的药物亲和性及药代动力学性质，结果表明大多数指标在推荐值范围内，展现衍生物作为安全有效的Topos双重抑制剂的潜力。本课题为后续Topo双靶点抑制剂的开发提供了一定的实验依据和理论基础。
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