摘要
呕吐毒素（Deoxynivalenol，DON）是常见的霉菌毒素之一，是镰刀菌属真菌在代谢过程中产生的有毒次级代谢产物，DON污染的饲料给养殖业造成了巨大损失。研究发现奶牛摄入含有DON的饲料后会引起泌乳量和奶品质下降，同时引起消化道的生理功能紊乱，从而导致消化系统炎症的发生，影响机体对营养物质的消化和吸收，进而影响动物的日增重和生产性能。中药单体来源广，副作用小，具有抑菌抗炎等生物学功能且不易产生耐药性。鉴于此，本研究以牛小肠上皮细胞（bovine intestinal epithelial cells，BIECs）为体外研究对象，建立DON作用的BIECs细胞模型，探明DON对BIECs的损伤的作用机制，同时通过检测姜黄素（Curcumin，CUR）等9种中药单体对DON造成的细胞损伤的保护作用，综合筛选出对DON具有解毒保护作用的中药单体。具体研究如下： （1）DON引起BIECs发生氧化应激和细胞凋亡：首先，本研究通过将不同浓度的DON加入至BIECs中，通过观察细胞形态变化和CCK-8测定细胞活性，建立DON感染BIECs的细胞模型。研究发现，0.5μg/mL及以上浓度的DON诱导处理BIECs24 h可显著改变BIECs的细胞形态，细胞活力降低至58.69%。进一步的研究发现DON促使BIECs中活性氧（ROS）大量产生，改变细胞氧化还原状态，出现氧化应激，发生氧化损伤；JC-1染色结果显示，DON造成BIECs的线粒体膜电位下降；采用AnnexinV/FITC/PI染色发现DON能诱导BIECs的凋亡；Real-time PCR检测发现细胞凋亡相关基因Caspase-3和Caspase-9相对表达量上调显著（P＜0.01），进一步证明了细胞凋亡的产生。与此同时， DON使抗氧化应激蛋白Nrf2和NQO1升高，抗氧化因子HO-1下调（P＜0.01），说明氧化应激的发生和抗氧化应激蛋白的下降有关；氧化应激相关的促炎因子IL-1 ， IL-6及COX-2的mRNA表达丰度显著上调（P＜0.01），说明DON引起BIECs细胞内炎性因子的上升，改变其正常生理功能，诱导了炎症的产生。 （2）缓解DON诱导BIECs损伤的中药单体的筛选：在确定CUR等9种中药单体的安全剂量的基础上，以0.5μg/mL DON作用的BIECs为模型，同时分别加入9种中药单体成分，通过细胞活性和细胞形态的变化筛选出对DON引起的细胞损伤具有保护作用的中药单体成分，研究发现，紫檀芪（Pterostilbene，PTE）、甘草酸（Glycyrrhizic acid，GA）和CUR分别与DON共同作用于BIECs 24 h，与DON对照组相比，细胞形态接近于空白对照组且细胞活力显著提高（P＜0.01），分别达到84.72%、82.48%和88.11%，同时证实了这三种中药单体对DON引起的氧化应激等具有缓解作用。ROS检测结果提示CUR使DON引起BIECs产生的ROS含量显著下降（ P＜0.01 ）；线粒体膜电位水平检测， AnnexinV/FITC/PI 细胞凋亡检测发现CUR等对DON诱导的细胞凋亡起抑制作用，与氧化应激相关转录因子Nrf2以及受其调控的NQO1蛋白的mRNA表达水平下降（P＜0.01），而HO-1表达水平略有升高，表明PTE和CUR有助于改善细胞的氧化应激状态。与此同时，促炎因子IL-1，IL-6 及COX-2和凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-9的mRNA表达丰度显著下调（P＜0.01），表明PTE、GA和CUR可以缓解DON引起的BIECs的细胞损伤。 （3）PTE和CUR对DON诱导小鼠肠道损伤模型的缓解作用：为了进一步明确中药单体对DON引起毒性损伤的治疗效果，本研究进一步通过灌胃方式建立PTE和CUR缓解DON诱导的小鼠损伤模型，记录采食量及体重，并通过血液血清生化指标、肠道及肝脏的病理组织学观察等明确中药单体成分PTE和CUR对小鼠DON模型的治疗作用。研究结果表明，PTE和CUR显著缓解DON对小鼠体重增长的影响（P＜0.01）；血清生化指标结果显示：DON组ALT、ALP升高，表明DON造成肝脏功能损伤，而缓解组AST和ALP水平接近正常，表明PTE和CUR对DON诱导的肝功能损伤有保护作用；HE染色结果证明PTE和CUR添加组的肝脏组织受损伤减少，尤其是CUR添加组肝细胞结构更接近于空白对照组。肠道组织病理学切片可以看出PTE和CUR添加组的绒毛高度和隐窝深度均显著改善（P＜0.01），qRT-PCR检测结果发现抗氧化应激蛋白Nrf2以及NQO1蛋白的mRNA表达水平下降，而HO-1表达水平升高（P＜0.01），与体外牛小肠细胞检测结果基本一致。促炎因子IL-1 ， IL-6及COX-2的mRNA表达丰度显著下调，并且凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-9相对表达量下调显著（P＜0.01），进一步表明PTE和CUR对DON诱导肠道损伤有缓解作用。 总之，本研究首次以BIECs为体外模型，明确了DON对BIECs的毒性作用与引起细胞发生氧化应激具有密切关系。在此基础上，探明中药单体PTE和CUR等对DON造成的损伤的缓解和治疗作用，为DON的致病机制以及防治提供了基础数据和科学资料。
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