摘要
肺癌是一种进展快、易转移、多复发和预后差的恶性肿瘤。肺癌患者常常伴随多种癌基因的改变，其中，最常见的基因改变类型为KRAS突变，其突变率高达30%。KRAS突变是导致肺癌患者预后差、易复发的关键因素。目前临床上针对KRAS突变肺癌仍然缺乏有效的治疗策略，深入解析KRAS突变肺癌的生物学特征是治疗该类肿瘤的突破口。 KRAS突变不仅可以改变肿瘤细胞本身的生物学功能，还可以与肿瘤免疫微环境相互作用来促进肿瘤的进展。肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤免疫微环境的重要组成部分，KRAS突变激活后会促进肿瘤相关巨噬细胞的募集，诱导巨噬细胞向M2型极化。由于巨噬细胞具有高度可塑性，在响应肿瘤微环境信号时容易发生重编程导致巨噬细胞衰老。最新研究发现，在KRAS驱动的肺癌中具有衰老巨噬细胞群，清除该类衰老巨噬细胞能够显著降低KRAS突变肿瘤的负担。上述研究提示，巨噬细胞衰老可能介导肿瘤免疫逃逸调控KRAS突变肺癌的发展，然而巨噬细胞衰老在KRAS突变肺癌发生发展中的具体功能及作用机制未见报道。 为了明确KRAS突变肺癌微环境对巨噬细胞衰老的影响，我们通过β半乳糖苷酶染色实验发现，KRAS突变细胞条件培养基能够促进巨噬细胞衰老。随后我们将衰老巨噬细胞与肺癌细胞共培养发现，衰老巨噬细胞对肺癌细胞的吞噬能力显著降低。进一步通过对KRAS突变细胞培养基中外泌体的蛋白组数据进行分析发现，在KRAS突变肿瘤细胞培养基中，外泌体中CD47显著增多。减少外泌体中CD47能有效抑制KRAS突变肺癌细胞诱导巨噬细胞衰老，恢复巨噬细胞的吞噬能力。我们通过转录组学测序进行初步机制探究，结果显示外泌体中CD47可能通过NF-Kappa B信号通路调节巨噬细胞衰老。 此外，我们也检测了细胞膜上的CD47对肿瘤细胞本身生物学功能的影响，体外细胞实验证明敲低CD47能够显著抑制KRAS突变肺癌细胞的增殖和迁移能力，促进肿瘤细胞的凋亡。随后我们构建了LSL-KrasG12D/+;CD47flox/flox小鼠肺癌模型和LSL-KrasG12D/+小鼠肺癌模型，结果显示，利用基因干预和特异性单抗阻断CD47的功能后均可有效减缓KRAS突变肺癌的发展。 由于在各项临床试验中CD47抗体对红细胞具有毒副作用以及对实体肿瘤的治疗效果较差，筛选联合用药方案是克服该类问题的重要策略，而CRISPR/Cas9体系能够高效地进行功能性基因筛选，因此我们通过表观遗传相关基因CRISPR/Cas9文库进行筛选，旨在鉴定出能够与CD47单抗发挥协同抑癌的靶点基因。CRISPR/Cas9体系筛选结果发现，CD47单抗处理组中BRD3基因的sgRNA显著缺失，提示BRD3基因可能与CD47单抗具有协同作用。随后通过体外细胞实验和小鼠种植瘤模型证明，基因干预和抑制剂阻断BRD3功能后可有效增强CD47单抗的肿瘤杀伤能力。 综上所述，本研究深入解析了KRAS突变肺癌中衰老巨噬细胞群功能及其调控机制，揭示细胞膜上CD47和外泌体中CD47在KRAS突变肺癌发生发展中的功能，为KRAS突变肺癌的有效治疗提供新理论和新视角。
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