摘要
猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)是一种高度传染性病原体，一直以来对我国养猪业构成严重威胁。目前，我国防控猪瘟(Classical swine fever,CSF)的主要方式是疫苗接种，且大多使用减毒活疫苗(C株)，但该疫苗不能从血清学上区分感染动物和接种动物(Differentiation of infected and vaccinated animals,DIVA),不利于该病的净化。虽然以CSFV E2蛋白为靶标的亚单位疫苗也能提供完全保护，但其免疫保护效果弱于C株，并且需要加强免疫。另外，E2蛋白亚单位疫苗主要依靠体液免疫发挥作用，无法在免疫早期诱导IFN-γ以提供保护作用。 纳米颗粒(Nanoparticles,NPs)疫苗平台能够安全、有效地增强抗原的免疫原性。基于NPs的疫苗在大小和抗原结构上与天然病毒相似，纳米级的尺寸使其更容易被树突状细胞等抗原递呈细胞捕获，不仅可以通过交叉递呈的方式诱导细胞免疫，而且还能够被捕获至引流淋巴结持续刺激体细胞超突变，诱导更高水平的特异性中和抗体，利用其递送蛋白抗原可以达到与减毒活疫苗相当的免疫效果。此外,此类疫苗还具有DIVA特性。因此，利用NPs疫苗平台递送CSFV E2蛋白，研发免疫效果媲美C株的亚单位疫苗具有明显的优势和应用前景。 本研究采取了一种来自幽门螺杆菌的天然非血红素铁蛋白(ferritin)自组装纳米颗粒表面展示CSFV E2蛋白的新策略。我们利用慢病毒系统构建稳定表达带有SpyTag序列的E2蛋白(SpyTag-E2)的CHO悬浮细胞系，该细胞系能够稳定分泌表达抗原。同时我们还构建了能够稳定表达SpyCatcher-ferritin NPs(SC-ferritin NPs)的大肠杆菌BL21菌株，以此建立一个通用型的NPs疫苗递送平台。通过体外偶联方式成功地将E2蛋白装载到SC-ferritin NPs表面，并通过尺寸排阻色谱法纯化E2蛋白NPs(E2-ferritin NPs)。经负染电镜观察到纳米颗粒的形成。在家兔模型上，我们发现20 μg E2-ferritin NPs单剂量免疫诱导了与C株疫苗相当的细胞免疫反应及更强的体液免疫应答。随后，我们以50μg的剂量在猪体上进行了免疫攻毒保护评价，结果显示,E2-ferritin NPs能够迅速诱导显著高于E2亚单位疫苗的体液免疫和细胞免疫反应，在致死剂量的CSFV石门株(CSFV-SM)攻毒后，E2-ferritin NPs免疫猪无病毒血症和排毒情况，无任何临床症状，诱导了完全保护。动物实验结果表明，与普通E2蛋白和已有的商品化E2亚单位疫苗相比，NPs显著提高了体液免疫和细胞免疫水平，并提供了完全的攻毒保护。 综上所述，我们通过NPs疫苗平台制备了 E2-ferritin NPs,并在家兔和猪体上评价了其免疫保护效果，NPs展示显著增强了 E2亚单位疫苗的免疫原性，为研制用于CSF净化的可替代C株的亚单位疫苗奠定了基础。
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