摘要
目的：龙葵果（Solanum Nigrum fruit）是一种可食用的药用浆果，为茄科植物龙葵的成熟果实，龙葵果含有丰富的生物活性成分，如生物碱、皂苷、黄酮、酚酸、花青素等，这些生物活性成分具有抗炎、抗氧化、增加肠道菌群丰度、抗肿瘤等作用。然而有关龙葵果抗乳腺癌的有效成分及关键机制尚未完全明确，因此，本研究以龙葵果为研究对象，优化龙葵果植物化学成分提取条件，探究抗氧化能力和对乳腺癌细胞增殖活性的影响，并建立龙葵果体外活性成分库，利用网络药理学技术分析龙葵果发挥抗乳腺癌的活性成分及作用机制。 方法：1.本研究采用单因素法对龙葵果植物化学成分的提取条件进行了优化。提取过程分别考察了提取溶剂、时间、温度、料液比，每个提取条件考察了三个不同水平，其中提取溶剂分别考察了乙醇∶醋酸∶水（1∶1∶8）、乙醇∶醋酸∶水（5∶1∶4）、乙醇∶醋酸∶水（9∶1∶0）;提取时间考察了40min、80min、120min;提取温度考察了40℃、60℃、80℃;提取料液比考察了1∶8、1∶14、1∶20,并用色谱法检测成分提取总量，从而确定龙葵果的提取条件。 2.本研究分别采用DPPH法、ABTS法、FRAP法对龙葵果的抗氧化活性进行评价。以衍生于水溶性维生素E的抗氧化剂Trolox为标准品，按照试剂盒要求，测定三种实验方法中不同浓度Trolox和空白组的吸光度值，绘制标准曲线并计算标准曲线方程，测定龙葵果在不同方法中的吸光度值，并通过标准曲线方程计算龙葵果的清除能力，龙葵果抗氧化能力以Trolox/mL为单位表示。 3.本研究采用CCK-8测定MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468细胞增殖活性。对不同浓度龙葵果（0、0.05、0.25、0.5、1、2mg/mL）处理的MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468细胞和空白组（既没有龙葵果也没有细胞悬液）在波长450nm下进行吸光度测定，并通过公式：存活率％=（A实验-A空白）/（A对照-A空白）×100％计算细胞生存率、IC50值及不同浓度龙葵果处理后的三种乳腺癌细胞活性变化是否具有统计学意义。 4.采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术在正、负离子模式下鉴定龙葵果的活性成分，运用MSDAIL软件，对龙葵果化合物保留时间、二级离子等信息进行整理和分析，并结合文献报道等多方面信息，最终确定龙葵果中植物化学成分。 5.基于鉴定出的龙葵果活性成分绘制“龙葵果活性成分-靶点-乳腺癌”网络，得到龙葵干预乳腺癌的作用机制。运用Swiss Target Prediction数据库对龙葵果活性成分进行核心靶点的筛选，同时于GeneCards、TTD、OMIM数据库收集乳腺癌相关的疾病靶点。将龙葵果潜在活性成分的靶点与乳腺癌相关的疾病靶点导入Venny2.1平台获得交集基因，再利用STRING数据库结合Cytoscape3.9.1软件绘制关键靶点的PPI网络和“龙葵果活性成分-靶点-乳腺癌”网络。应用Matescape数据库分别进行关键靶点的GO功能分析和KEGG通路分析，最终得到龙葵果潜在活性成分抗乳腺癌作用的靶点及通路。 6.基于“龙葵果活性成分-靶点-乳腺癌”网络和PPI网络结果，筛选龙葵果中关键成分抗乳腺癌潜在靶点，通过分子相互作用仪检测龙葵果关键成分与乳腺癌靶点的结合力。将龙葵果关键成分澳洲茄碱和乳腺癌ESR1蛋白分别溶于PBS-T,使用荧光染料标记ESR1蛋白，将标记好的荧光蛋白与不同浓度澳洲茄碱混合，毛细管吸取混合液，并在分子互作仪中检测二者是否发生结合及结合力（Kd值），以期模拟及验证“龙葵果活性成分-靶点-乳腺癌”网络构建结果部分靶点对接情况。 结果：1.通过单因素法对龙葵果提取溶剂的考察中，色谱峰总面积由大到小依次为：乙醇∶醋酸∶水（5∶1∶4）、乙醇∶醋酸∶水（1∶1∶8）、乙醇∶醋酸∶水（9∶1∶0）;对龙葵果提取温度的考察中，色谱峰总面积由大到小依次为：80℃、40℃、60℃;对龙葵果提取时间的考察中，色谱峰总面积由大到小依次为：40min、80min、120min;对龙葵果提取料液比的考察中，色谱峰总面积由大到小依次为：1∶20、1∶14、1∶8。最终确定龙葵果提取条件为：提取溶剂乙醇∶醋酸∶水（5∶1∶4）、温度80℃、提取时间40min。 2.在上述考察的提取条件(提取溶剂乙醇∶醋酸∶水(5∶1∶4)、温度80℃、时间40min、料液比1∶20)下，对龙葵果植物化学成分提取得龙葵果，分别考察了其对DPPH、ABTS、FRAP的清除能力，结果表明龙葵果抗氧化能力分别为1.7μmol Trolox/mL、3.4μmol Trolox/mL、0.98μmol Trolox/mL。 3.通过CCK-8法检测不同龙葵果对MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468乳腺癌细胞增殖活性，结果表明MCF-7、MDA-MB-468细胞在龙葵果浓度0.25mg/mL时细胞活性开始下降(P＜0.05);MDA-MB-231细胞在龙葵果浓度0.05mg/mL时细胞活性开始下降(P＜0.05)。龙葵果对三种乳腺癌细胞5均有抑制增殖作用，三种细胞的半抑制浓度(IC50)分别为：0.5937、0.2825、0.3227mg/mL。 4.UPLC-Q-TOF-MS/MS中鉴定出龙葵果包括知母皂苷B等10种皂苷、阿魏酸等15种酚酸、澳洲茄碱等7种生物碱、芦丁等5种黄酮、37种其他植物化合物。结果表明在上述提取条件下，龙葵果中酚酸和皂苷类化合物居多。 5.龙葵果中78个活性成分筛选出652个靶点，其中有40个活性成分与抗乳腺癌靶点存在联系，TTD、GeneCards、OMIM数据库中筛选出乳腺癌靶点599个，龙葵果活性成分-乳腺癌共同靶点共有72个，“龙葵果活性成分-靶点-乳腺癌”网络与PPI网络表明龙葵果中芦丁、澳洲茄碱等关键活性成分通过AKT1、ESR1、CA2等靶点干预乳腺癌发生发展。 6.基于网络药理学筛选结果，选取龙葵果中关键成分澳洲茄碱与乳腺癌关键靶点ESR1蛋白，对二者进行结合力实验测定，结果表明在ESR1蛋白与荧光标记的染料结合良好，经荧光染料标记的ESR1蛋白与澳洲茄碱作用后平均荧光强度为244cunts，结合力为33.3nM。 结论：本研究采用单因素法确定龙葵果的提取条件，探究龙葵果抗氧化能力与抗乳腺癌细胞增殖能力，基于UPLC-Q-TOF-MS/MS检测技术，鉴定龙葵果中植物化合物，并结合网络药理学技术，得到龙葵果活性成分潜在的干预乳腺癌的作用机制，从而实现对龙葵果植物化学成分及其抗乳腺癌、抗氧化生物活性作用研究。结果表明龙葵果具有抗氧化及抗乳腺癌细胞增殖能力，龙葵果(0.05mg/mL)的DPPH清除能力是水溶性维生素E(Trolox)的1.7倍，ABTS清除能力是水溶性维生素E(Trolox)的3.4倍，FRAP清除能力是水溶性维生素E(Trolox)的0.98倍。当龙葵果浓度达到0.25mg/mL时，MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468三种乳腺癌细胞增殖活性均有下降(P＜0.05),且MDA-MB-231细胞增殖活性对龙葵果表现最敏感，其IC50值为0.2825mg/mL,MCF-7和MDA-MB-468细胞的IC50值分别为0.5937mg/m和0.3227mg/mL。龙葵果含有澳洲茄碱、柠檬酸、芦丁等74种植物化学成分，其中以皂苷和酚酸类成分最为丰富。“龙葵果活性成分-靶点-乳腺癌”网络和PPI网络结果表明，在影响乳腺癌发生发展的过程中，有40种活性成分起到抗乳腺作用，其中澳洲茄碱、泛酸、獐牙菜苦甙等活性成分汇集的抗乳腺癌靶点较多，龙葵果中的活性成分可能是通过调控AKT1、EGFR、CA12等72个靶点及癌症通路、蛋白激酶结合等个225通路实现抗乳腺癌作用。在本研究中，采用分子互作实验进行龙葵果潜在活性成分抗乳腺癌靶点的体外模拟验证，发现潜在活性成分澳洲茄碱与ESR1靶点的结合力为33.3nM,表明二者确实发生结合，且结合力良好，这进一步表明龙葵果活性成分抗乳腺癌作用机制网络预测结果具有一定意义。
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