摘要
背景与目的： 蘑菇中毒一直是我国食品卫生的一大问题，ɑ-鹅膏毒肽（Alpha-amanitin,ɑ-AMA）和β-鹅膏毒肽（Beta-amanitin,β-AMA），是主要的致命毒素。适配体（Aptamer）被称为"化学抗体"，广泛应用于食品检测领域。但由于α-AMA、β-AMA二者结构相似、分子量差异小，因而存在适配体筛选效率低且亲和力不强等问题。截止目前，尚未报道相关的电化学适配传感器。 本研究提出了一种新型无标记SELEX技术，用于同时筛选靶向α-AMA、β-AMA的特异性适配体。并将筛选得到的序列进行分析优化后，作为识别探针，构建电化学适体传感器用于α-AMA、β-AMA的超灵敏检测。 材料与方法： 1.新型无标记SELEX技术用于高效筛选鹅膏毒肽特异性适配体 本文提出了一种基于正电性金纳米（Gold nanoparticles,AuNPs）的新型无标记SELEX技术，用于同时筛选靶向α-AMA、β-AMA的特异性适配体。前期筛选中将α-AMA、β-AMA作为共同靶标进行同步SELEX。当富集效率达到一定程度时，将二者作为单独靶标进行分离SELEX。通过监测文库回收率评估筛选的进程，当回收率稳定时，将产物进行测序、同源性分析。并采用胶体金法分析候选适配体的亲和力。随后，通过分子力对接模拟、圆二色谱技术（Circular dichroism,CD）初步探讨了α-AMA、β-AMA与适配体的结合模式和活性位点。基于分子力对接的结果与适配体的二级结构，并对序列进行了优化截短。最后采用SYBR Green I荧光分析法分析截短后适配体的亲和力与特异性。 2.基于功能核酸探针及双酶辅助信号放大策略构建鹅膏毒肽电化学适配体传感器 将截短后的序列作为识别探针，构建了基于目标物诱导的链释放，DNAzyme、核酸外切酶I（Exonuclease I,Exo I）级联循环信号放大策略的α-AMA、β-AMA电化学适体传感器。适配体与DNAzyme通过HCR反应形成polymer长链，目标物与适配体结合后从polymer中释放出多条DNAzyme对发夹探针进行剪切。在Exo I介导下触发目标物循环，从而增强电化学信号。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）验证可行性。采用胶体金法表征polymer释放的DNAzyme的实时行走过程，并在最优条件下评价传感器检测性能以及在实际应用中的稳定性。 结果： 1.新型无标记SELEX技术用于高效筛选鹅膏毒肽特异性适配体。同步SELEX进行了12轮，相对回收率达到稳定水平，从第13轮开始进行分离SELEX。α-AMA、β-AMA二者的富集率在第17轮达到最高，并在第18轮有所下降，将第17轮的产物进行PCR扩增后测序。获得了492条靶向α-AMA的序列和384条针对β-AMA的序列。根据二级结构、自由能（ΔG）和亲缘性分析筛选出了8条典型序列：ɑ-26、ɑ-30、ɑ-41、ɑ-62、β-31、β-41、β-37和β-65。进一步的亲和力结果表明，候选适配体序列的解离常数（Dissociation constant,Kd）分别是：ɑ-30（22.26nM）、ɑ-41（27.73nM）、ɑ-26（24.74nM）、ɑ-62（31.27nM）、β-37（23.32nM）、β-41（27.64nM）、β-65（26.77nM）、β-31（25.10nM）。将适配体序列与靶标的三维结构进行分子力对接模拟，结果表明ɑ-30序列中13T、24T、47G、48G、49T、50G、51C、61T、62A、63G、65C可能为活性结合位点。51G、53C、54G、65T、66T、67G为可能为β-37序列的活性结合位点。CD结果表明，目标物与适配体是通过嵌入式结合的。最后，对序列截短优化后发现，截短体ɑ-30-2和β-37-2表现出比原始的序列更高的亲和力。 2.基于功能核酸探针及双酶辅助信号放大策略构建鹅膏毒肽电化学适配体传感器。动力学结果显示，polymer长链具有更高的动力学效率，加速了消化反应，动力学参数k19min=0.02139。该传感器在10pg/mL~100ng/mL范围内，电信号与α-AMA、β-AMA浓度呈线性关系。α-AMA适配体传感器的回归方程为I=0.31910LgC-2.75169（R2=0.997），检测限为4.57pg/mL。β-AMA传感器的回归方程为I=0.36459LgC-2.77491（R2=0.998），检测限为8.49pg/mL。α-AMA、β-AMA传感器均表现出了优异的稳定性（RSD=4.68%,3.10%）、可重复性（RSD=6.51%,7.05%）和选择性。采用加标回收法，对市场收集的野生菌中进行加标回收分析，所测得α-AMA、β-AMA的回收率分别为101.13%~124.00%和101.29%~109.30%。在人工尿液样品中，回收率分别为98.50%~100.60%和96.00%～100.65%。 结论： 1.本研究将正电性AuNPs作为筛选介质，建立了无标记SELEX技术。这种策略适用于结构相似小分子的适配体筛选，无需对文库进行化学标记或盐离子的诱导，在极大程度保证亲和力的同时提高了筛选效率、降低了成本。通过筛选获得了得到靶向ɑ-AMA、β-AMA的适配体，为生物传感器的构建提供了生物受体。 2.采用截短后的适配体序列作为识别探针，构建了基于目标物诱导的链释放，Exo I、DNAzyme级联循环的α-AMA、β-AMA电化学适体传感器。Polymer长链结构表现出更高的动力学效率，加快了消化反应。该检测平台显示出优越的分析性能，可望用于现场样本检测。
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