摘要
免疫治疗因其特异性强、可高效清除残留肿瘤细胞及有效防止肿瘤复发等优点而被广泛应用于恶性肿瘤治疗。然而，由于肿瘤快速生长产生的免疫抑制微环境会导致其治疗效果不理想。本研究构建了一种共载阿霉素（adriamycin，DOX）、4-苯基咪唑（4-Phenylimidazole，4PI）和胞嘧啶磷酸鸟嘌呤（Cytosine phosphate guanine， CpG）的纳米凝胶DOX-4PI@CpG@Lipo@Gel(DPCLG)，该体系将化疗和免疫治疗两种治疗方式有效的联合起来，通过增强癌细胞的免疫原性死亡可以达到良好的肿瘤免疫治疗效果，为恶性肿瘤的治疗提供了新的策略。 本研究首先通过薄膜水化法在脂质体(Liposomes)的疏水腔中装载吲哚胺2,3-双加氧酶1（indoleamine2,3-dioxygenase1，IDO-1）抑制剂4PI，通过pH梯度法在其亲水腔中装载广谱化疗药物DOX，得到DOX-4PI@Lipo（DPL）。进一步通过薄膜水化法制备甘露糖基修饰的阳离子脂质体，在其表面通过静电吸附免疫佐剂CpG，得到CpG@Lipo（CL）。最后通过化学交联法将多肽-SH和马来酰亚胺反应，同时加入两种脂质体，即得到具有基质金属蛋白酶Ⅱ（matrix matalloproteinases 2，MMP-2）响应的纳米凝胶DPCLG。该纳米载药系统平均粒径为285.0±2.13 nm，Zeta 电位为-5.2±0.8 mV，PDI为0.154±0.05，具有较好的分散性。同时DPCLG可高效负载DOX和4PI，二者包封率分别为81.25%±1.3%和85.97%±0.9%，载药量分别为4.32%±0.7%和4.68%±1.1%。多肽-SH具有MMP-2响应的特性，故该纳米凝胶可以通过EPR效应准确的在肿瘤部位释放出两类脂质体，有效实现药物的控制释放。 其次，细胞摄取实验结果表明肿瘤细胞对DPCLG纳米粒子具有高摄取能力；CCK-8实验、细胞活/死染色实验、线粒体膜电位实验和细胞凋亡实验结果均表明DPCLG纳米粒子具有良好的肿瘤细胞杀伤能力；埃里希实验结果表明DPCLG纳米粒子可以有效的抑制IDO-1的活性，从而下调色氨酸的转化率；利用流式细胞术对M1和M2型巨噬细胞表面抗原进行抗体染色，验证了DPCLG纳米粒子具有将M2型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞的优异能力；ELISA检测以及免疫荧光染色结果表明该纳米粒子可诱导产生强大的免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death，ICD)效应；细胞划痕和迁移实验结果均表明了DPCLG纳米粒子对癌细胞的迁移和侵袭具有显著的抑制作用。 最后，通过建立小鼠荷宫颈癌U14远位模型以及肺转移模型，对不同组小鼠进行多种方案药物处理，评估DPCLG纳米粒子对宫颈癌的治疗作用以及体内安全性。小鼠体内荧光成像实验结果表明DPCLG纳米粒子在小鼠体内具有优异的肿瘤靶向性；荷瘤小鼠肿瘤增殖曲线结果显示，DPCLG纳米粒子可显著抑制原位和远位U14肿瘤增殖，原位肿瘤生长抑制率可以达93.3±1.9%。肿瘤组织切片H＆E、Ki-67和TUNEL染色结果均表明DPCLG纳米粒子可以显著的抑制肿瘤细胞的增殖，引起肿瘤组织大面积的凋亡和坏死；流式细胞术和ELISA实验结果显示，DPCLG纳米粒子可激活肿瘤组织CD8+T细胞浸润，促进树突状细胞成熟及抑制调节性T细胞活化，上调抗肿瘤细胞因子，说明该纳米粒子诱引起了强大的免疫反应，改善了肿瘤的免疫抑制微环境；蛋白印迹结果表明DPCLG纳米粒子可有效下调IDO-1酶的表达。在整个实验过程中，小鼠的体重稳定增长，器官指数以及主要器官的病理切片与正常对照组小鼠相比均无显著变化，说明了DPCLG纳米粒子在体内具有良好的安全性。通过小鼠肺转移模型的建立与药物处理，进一步说明DPCLG纳米粒子可以显著抑制癌细胞的肺转移扩散。 本研究所构建的DPCLG纳米载体实现了化疗和免疫治疗的有效联合，表现出良好的体外、体内抗肿瘤效果，激活了强大的机体免疫反应。该研究将为癌症治疗提供临床依据以及新的治疗思路。
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