摘要
研究背景与目的： 口腔鳞状细胞癌（OSCC）是口腔癌中最常见的恶性肿瘤，其特点是恶性程度高、发展迅速及死亡率高。微小RNA（miRNA）是一类长度大约为18~25个核苷酸的非编码RNA小分子，通过与靶基因mRNA的特定序列结合，能够抑制其翻译或促进其降解，从而调控细胞内多种生物学过程。研究表明，一些miRNA在OSCC组织中表达异常，通过调控miRNA的表达水平，可以影响OSCC细胞的增殖、侵袭和转移能力。然而，由于肿瘤发生机制的复杂性及肿瘤细胞的高度异质性和适应性，导致单一miRNA的干预难以有效调控这些复杂的生物过程且容易被肿瘤细胞通过其他途径逃逸。因此有学者提出基于miRNA的联合治疗策略，例如将其与化疗药物、放疗等治疗手段相结合以增强治疗效果。值得一提的是，该策略同样适用于miRNA之间的联合应用，利用miRNA多靶点即同时调控多个靶基因的特性，在抑癌性miRNA中进一步筛选具有协同抗癌活性的双联miRNAs，作用于靶细胞使之从不同途径调控肿瘤细胞的生长及转移，从而实现其协同增效的治疗效果。有研究报道，miR-145-5p和miR-132-3p在OSCC组织中特异性低表达，而它们的过表达能够抑制肿瘤细胞增殖即具有抗癌潜力，但目前关于miR-145-5p和miR-132-3p的协同抗癌活性及具体机制尚未见报道。 基于此，本研究以OSCC细胞株HSC-3和HSC-4作为实验对象，第一部分通过转染miRNA模拟物（mimic）筛选确认miR-145-5p联合miR-132-3p具有协同抗癌活性。第二部分利用分子克隆技术构建双联miRNAs（miR-145+132）真核表达载体，该载体内包含两个miRNA前体序列，辅以强启动子和增强子以确保这两个miRNA的高效共表达。将双联miRNAs真核表达载体转入细胞后，miRNA前体可以通过细胞内正常的生物合成过程加工为成熟的miRNA，以此保障miRNA的生物学功能更接近于生理状态，进一步通过体外实验研究双联miRNAs表达对OSCC细胞增殖活性的影响及其分子机制。本研究为抗OSCC药物治疗提供新的思路和选择，并有望推进抗OSCC治疗的研究进程，具有广阔的研究和应用前景；另外，双联miRNAs表达载体的构建为未来多靶点联合治疗策略奠定了坚实的技术基础。 材料与方法： 第一章 1. 通过CCK-8法检测miR-145-5p和miR-132-3p mimic联合转染后对HSC-3和HSC-4细胞增殖能力的影响；并运用金正均Q值法评估二者的协同效应； 2. 利用DCFH-DA染色检测细胞内活性氧（ROS）水平，Annexin V-FITC/PI双染分析细胞凋亡情况，JC-1染色评估线粒体膜电位（MMP）变化；通过以上实验结合流式细胞仪检测并分析miR-145-5p联合miR-132-3p对HSC-3和HSC-4细胞的ROS、凋亡和MMP的影响； 3. 通过 Western Blot 技术检测 miR-145-5p 联合 miR-132-3p 对 HSC-3 和HSC-4细胞凋亡相关蛋白和线粒体途径Bcl-2家族蛋白表达水平的影响； 4. 通过RNA-seq分析HSC-3细胞经miR-145-5p和miR-132-3p联合处理后mRNA水平上的基因差异表达情况，并对显著差异基因（DEGs）进行功能富集分析。 第二章 1. 利用分子克隆技术构建含有pre-miR-145和pre-miR-132的双联miRNAs真核表达载体，并通过PCR、双酶切及测序鉴定所设计序列插入克隆载体是否准确无误；采用流式细胞仪及倒置荧光显微镜进行蓝色荧光示踪，以判断重组质粒转染目标细胞后的转染情况；RT-qPCR验证该重组载体是否能够有效地在目标细胞中表达双miRNAs； 2. CCK-8法检测双联miRNAs表达对HSC-3和HSC-4细胞增殖活性的影响；3. 通过DCFH-DA、Annexin V-FITC/PI及JC-1染色结合流式细胞仪分析双联miRNAs表达对HSC-3和HSC-4细胞ROS、凋亡以及MMP的影响；进一步利用Western Blot检测双联miRNAs高表达对HSC-3和HSC-4细胞凋亡相关蛋白和线粒体途径Bcl-2家族蛋白表达水平的影响； 4. 通过RNA-seq技术分析HSC-3细胞在双联miRNAs表达后mRNA水平上的基因差异表达情况，并对DEGs进行功能富集分析。 5. 通过碘化丙啶（PI）荧光染色及流式细胞仪检测分析双联miRNAs表达对HSC-3和HSC-4细胞周期的影响；并利用Western Blot检测细胞周期、P53及MAPK信号通路相关蛋白表达水平。 结果： 第一章 1. CCK-8 结果显示， miR-145-5p 联合 miR-132-3p 能明显抑制 HSC-3 和HSC-4细胞增殖；其药物相互作用指数Q值分别为2.26和1.73，Q≥1.15被定义为二者具有协同作用； 2. DCFH-DA、Annexin V-FITC/PI及JC-1染色结果显示， miR-145-5p联合miR-132-3p诱导HSC-3和HSC-4细胞内ROS上升、凋亡比例增加、MMP降低； 3. Western Blot 结果显示， miR-145-5p 联合 miR-132-3p 能诱导 HSC-3 和HSC-4细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和Cleaved PARP的表达，降低抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl的表达以及上调促凋亡蛋白Bax的表达； 4. RNA-seq分析显示，miR-145-5p联合miR-132-3p可诱导HSC-3细胞1204个基因显著差异表达；GO分析显示DEGs主要涉及细胞因子、免疫反应、DNA结合等；KEGG分析显示DEGs主要富集的信号通路有TNF、IL-17、HIF-1等。 第二章 1. PCR、双酶切及测序结果显示，pre-miR-145+IRSE+pre-miR-132序列插入克隆载体位置、大小准确无误；重组质粒转入目标细胞后，通过流式细胞仪及倒置荧光成像观察蓝色荧光所占活细胞比例，判断其转染效率为40%~50%左右；RT-qPCR结果显示，重组质粒转入目标细胞后miR-145-5p和miR-132-3p的表达水平显著升高； 2. CCK-8结果显示，双联miRNAs高表达能抑制HSC-3和HSC-4细胞增殖；3. DCFH-DA、Annexin V-FITC/PI及JC-1荧光染色结果显示，双联miRNAs高表达能诱导HSC-3和HSC-4细胞内ROS水平上升、凋亡比例增加、MMP降低；Western Blot结果显示，胞内上调双联miRNAs表达能调控细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和Cleaved PARP的表达，降低抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl的表达以及上调促凋亡蛋白Bax的表达； 4. RNA-seq分析发现双联miRNAs高表达能诱导HSC-3细胞内3065个基因显著差异表达；GO分析显示DEGs主要涉及细胞周期调节、DNA结合等；KEGG分析显示DEGs主要富集的信号通路有TNF、IL-17、P53等； 5. PI染色结果显示，双联miRNAs高表达诱导HSC-3和HSC-4细胞发生G2/M期周期阻滞；Western Blot结果显示，胞内上调双联miRNAs表达能诱导周期相关蛋白PUMA、P21及p-P53的表达水平增高，且MAPK信号通路蛋白p-SAPK/JNK及p-P38表达增高、而p-ERK1/2的表达降低。 结论： 1. miR-145-5p联合miR-132-3p的协同抗OSCC作用：miR-145-5p联合miR-132-3p对HSC-3和HSC-4的增殖具有明显的协同抑制作用，其潜在的分子机制可能是通过ROS介导的线粒体凋亡途径诱导细胞死亡。 2. 双联miRNAs（miR-145+132）真核表达载体的构建和生物学效应：成功构建能同时表达miR-145-5p和 miR-132-3p的双联miRNAs真核表达载体，且实验验证其胞内上调双联miRNAs表达能够有效抑制HSC-3和HSC-4细胞增殖，并可通过MAPK信号通路和P53信号通路诱导细胞凋亡和周期阻滞。
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