摘要
苹果(Malus domestica Borkh.)，蔷薇科(Rosaceae)，苹果属(Malus pumilla Mill.),多年生乔木，是北温带地区主栽果树树种之一。苹果属植物的离体再生能力较差，转基因材料获得困难，严重限制了基因编辑技术的应用。本研究对苹果叶片再生体系的培养基成份进行了改良，使得‘嘎啦’和八棱海棠叶片的不定芽再生率达到100％。并在此基础上，从叶片状态、农杆菌类型、转化手法等方面改进了苹果叶盘转化体系，转化效率达到87.40％。此外，通过构建具有不同转录单元的基因靶向敲除载体，建立了一套适用于苹果的高效基因编辑体系，并获得了大量在靶向位点发生短片段插入或缺失的突变个体。 类异染色质蛋白LHP1是表观遗传调控因子PRC1的重要成员之一。LHP1通过与组蛋白H3.2互作识别H3K27me3修饰标记，抑制WUS等相关基因的表达。苹果MdLHP1可以响应干旱、低温、光、激素等多种环境信号，参与调控多个植物生长发育和逆境胁迫响应。为了研究该基因在调控苹果离体叶片再生过程中的作用，本研究应用所建立的苹果基因编辑体系获得了 Mdlhp1功能缺失突变体。相较于野生型，该突变体的不定芽再生能力显著提高。转录组分析结果表明，MdLHP1主要参与了植物光合反应、细胞周期调控、有性生殖以及激素合成代谢等多个生物学过程。在Mdlhp1突变体中，表达量受影响的基因包括很多参与植物细胞命运决定和器官分化再生的关键因子，如:花分生组织决定因子、晚期胚胎发育糖蛋白、花分生组织类受体激酶以及茎尖分生组织调控因子等。由此推测，Mdlhp1功能缺失突变体中不定芽再生能力的提升可能与这些基因的表达升高有关。 酶促褐变反应主要由多酚氧化酶PPO作用于其天然底物酚类物质而引起的。在组织培养过程中，外植体遭受机械损伤后，切面细胞中的酚类物质在有氧条件下被多酚氧化酶催化形成醌类物质，经由非酶促反应进一步聚合产生深褐色物质。这些大分子聚合物扰乱细胞代谢水平，抑制酶活性，进而导致组织褐变死亡。苹果中含有丰富的酚类物质，抑制褐化现象的产生不仅有助于提高果实的品质，也有利于促进离体再生。我们以果肉愈伤组织作为转化受体，获得了大量多酚氧化酶活性降低的Mdppo功能缺失突变体。该突变体的代谢组学分析结果表明，在831种差异代谢物中，酚酸类、吲哚类生物碱、三萜类以及酮类化合物的变化差异显著。本研究重点分析了银杏内酯、泛酚、乙酰氧基吲哚、4-氨基苯甲酸和丁香醛的代谢合成途径，试图挖掘苹果褐变的代谢基础。 苹果遗传背景复杂，基因高度杂合。传统的育种方式能够利用的遗传资源有限，难以实现优良性状的聚合，不能满足苹果产业发展的新需求。本研究从改进叶盘转化法入手，建立并优化了苹果的基因编辑体系，并从基因组和表观遗传学水平提高了苹果叶片的离体再生能力，为实现苹果遗传改良和种质创新提供了理论基础和实践依据。
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