氯离子通道CLC蛋白普遍存在于所有生命形式中，与其名称不同，CLC家族包括阴离子通道和质子耦联的阴离子逆向转运蛋白，它们通过驱动离子的跨膜转运来调控离子稳态以及细胞器的酸化。拟南芥AtCLCa定位于液泡膜，作为一个2NO3-/1H+逆向转运蛋白，对于NO3-转运到液泡中至关重要。近些年来，研究发现AtCLCa以及多种其他CLC蛋白的活性受到核苷酸和磷脂的调控，但是调控的分子机制并不了解。 在本项研究中，我们利用毕赤酵母表达并纯化了AtCLCa蛋白，并且将其重组进入纳米磷脂盘中以模拟其在生物膜中的天然状态。利用冷冻电镜技术，我们分别解析了AtCLCa结合底物NO3-(AtCLCa-NO3-)和Cl-(AtCLCa-Cl-)的冷冻电镜结构。AtCLCa形成同源二聚体，与之前的CLC结构相比，我们的AtCLCa结构揭示了一个新颖的N端β发夹结构，并且每个单体都结合了一个ATP和一个PI(4,5)P2分子。AtCLCa-NO3-结构呈现出离子转运通路开放的构象，与之前报导的CLC结构相同，而AtCLCa-Cl-结构则呈现出一个新颖的离子转运通路关闭的构象，在之前的CLC结构中从未观察到过。 两个AtCLCa结构都揭示了清晰的底物结合位点，在AtCLCa-Cl-结构中，之前CLC结构研究揭示的三个保守的阴离子结合位点都结合有Cl-,而在AtCLCa-NO3-结构中，只有中间位点和内部位点结合有NO3-。中间位点决定了CLC蛋白的底物偏好性，在Cl-选择性的CLC蛋白中，中间位点保守的丝氨酸侧链与Cl-形成氢键，而在AtCLCa结构中，保守的丝氨酸被Pro160取代，其侧链不能与阴离子形成氢键，这解释了AtCLCa特殊的偏好性的原因。 结构分析显示ATP可以结合在AtCLCa的C端CBS结构域和N端结构域形成的狭缝中，像一个分子胶水一样将CBS结构域和N端结构域粘合在一起，稳定了N端的β发夹结构，使其像一个塞子一样堵塞了阴离子转运通道的细胞质侧入口，因此抑制了AtCLCa的转运活性。基于结构的电生理学研究表明N端的β发夹结构对于保持ATP对AtCLCa的抑制作用是必要的，将ATP和N端结构域的互作位点突变会消除ATP的抑制作用。而AMP缺乏稳定N端的β发夹结构的β和γ磷酸基团，因此丧失了抑制AtCLCa的转运活性的能力。电生理实验进一步表明AMP可以与ATP竞争性结合从而减弱其对AtCLCa的抑制作用。我们的结构和电生理分析有助于理解AtCLCa如何感知叶肉细胞中生理状态下的ATP/AMP比率从而根据光合作用的活性来调节NO3-在液泡中的储存。 我们的结构信息首次揭示了PIP2分子可以结合在AtCLCa的二聚体交界面上，其肌醇头部占据了附近的质子转运通道的细胞质侧出口，可能因此抑制了AtCLCa的转运活性。这有助于理解生理情况下PI(3,5)P2如何通过抑制AtCLCa的转运活性从而促进ABA诱导的保卫细胞液泡酸化和气孔关闭。 我们的工作揭示了核苷酸和磷脂在特定生理场景下对AtCLCa转运活性的调控机制，并且序列分析显示这些调控机制在植物液泡膜定位的CLC蛋白中可能都是保守的。同时，我们的工作也为未来针对CLC的蛋白或小分子抑制剂设计奠定了结构基础。
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