摘要
水稻（Oryza sativa L.）是全球最重要的粮食作物之一，水稻整个生育期易遭受外界不利因素的影响，导致其生理活动不能正常进行，最终影响水稻的产量和品质。水稻类病斑形成会引起植株活性氧紊乱、细胞死亡及激素失衡等问题，常伴随着植株抗病性提高，防御相关基因表达增加。类病斑突变体（Lesion mimic mutant，Lmm）是研究植物细胞死亡和防御反应机制的重要材料。本研究通过EMS化学诱变剂处理武运粳 21(WT)，获得以武运粳 21为背景的突变体库，经多年表型观察，从突变体库中筛选到两个稳定的类病斑突变体：lm5（lesion mimic 5，以下简称 lm5）和 spl45（spotted leaf 45，以下简称 spl45）。通过对类病斑突变体的深入研究探索病斑形成的原因，挖掘控制类病斑发生的相关基因，将获得的突变体材料作为抗病育种的新资源。本研究对类病斑突变体lm5和突变体spl45表型和候选基因进行分析，得到以下结果： 1、突变体lm5基部叶片从分蘖期初期出现病斑表型，并表现出株高显著低于WT，一直持续到成熟期，其病斑表型可受光诱导产生；台盼蓝、DAB 染色表明突变体 lm5叶片存在ROS的积累及细胞死亡，生理指标测定表明叶片存在H2O2积累，H2DCF-DA染色发现突变体lm5叶片病斑周围有点状、群聚的ROS信号；突变体lm5在分蘖期色素含量均呈显著性降低，叶绿素相关基因 NYC1、NYC3、DVR等表达紊乱，叶绿体发育相关基因 HSA1、OsFLN2、OsTrxZ等表达紊乱，可能是叶片发育受到影响；与 WT相比，lm5的种子粒长变短，株高、有效穗、穗长、千粒重、一次枝梗数、二次枝梗数和结实率均显著降低。 2、遗传分析表明突变体lm5病斑表型受一对隐性核基因控制；利用F2群体和多态性标记确定候选基因位于7号染色体上，其第1130个碱基发生突变，由G突变为A，第377个氨基酸发生改变，由Arg变成Lys；对SF3b3蛋白同源分析发现其与小麦、谷子、高粱等植物的同源性高，部分物种序列比对表明其蛋白有高度的保守性；lm5病斑叶片ROS相关基因AOX1a、AOX1b、SODA1、CATB表达量显著上调，衰老相关基因OsWRKY2、OsWRKY7、OsNAC2、SGR表达显著增加，病程基因 PR10、JIOsPR10表达增强；表达模式分析发现基因LM5在根、茎、叶、鞘均有表达，亚细胞定位将LM5-GFP蛋白初步定位在细胞核和细胞质。 3、突变体lm5苗期根长显著低于WT；经DAB、NBT染色发现根中存在ROS和O2-的积累，H2O2酶活指标CAT、POD显著下降，SOD、MDA显著增加，表明根中存在H2O2积累，ROS相关基因AOX1b、SODA1、CATB表达量上升；外源施加不同浓度H2O2发现突变体lm5根长抑制程度增加，其根对H2O2更敏。 4、突变体spl45叶片从分蘖期初期出现黄褐色病斑表型，且一直到植株成熟期，病斑表型可受光诱导形成；经DAB、台盼蓝染色发现其病斑叶片存在活性氧的积累和大量细胞死亡， H2O2 相关酶活指标 CAT、POD 等进一步证明其叶片存在 H2O2 ，H2DCF-DA荧光染色表明突变体spl45叶片中大量ROS积累；突变体spl45分蘖期叶片叶绿素含量下降，叶绿体发育基因HSA1、OsFLN2、RpoA和RpoB等表达发生紊乱，叶绿素相关基因NYC4和DVR表达显著下降，超微结构观察叶片发现突变体spl45叶绿体发育异常；突变体spl45的株高、有效穗数、千粒重、一次枝梗、二次枝梗和结实率等农艺性状显著低于WT。 5、遗传分析表明spl45的病斑表型受一对隐性核基因调控；图位克隆将SPL45最终定位在10号染色体标记RM25658和RM6745之间，物理距离为453.6kb，区间包含了74个基因，49个已经被注释可能的功能的基因，19个编码表达蛋白的基因，6个已被报道的基因，包括三角形四肽重复蛋白、蛋白精氨酸甲基转移酶、水孔蛋白、ABC转运蛋白、微管切割酶、育性恢复基因；突变体spl45叶片中ROS相关基因AOX1a、AOX1b、SODA1、CATB表达显著增加，衰老基因OsI57、OsWRKY2、OsWRKY7、OsNAC2、SGR表达量上升，同时使植株自身病程基因NPR1、PR1a、PR1b、PR10、JIOsPR10表达量增加。 综上所述，突变体lm5叶片中产生更多ROS，引起细胞死亡，产生类病斑表型，同时活性氧的富集也影响了突变体lm5根的生长，LM5基因编码的SF3b3蛋白与小麦等单子叶植物同源性高且蛋白序列有高度保守性。突变体spl45叶片中检测到ROS的积累和细胞死亡，透射电镜分析发现其叶绿体结构被破坏，导致叶片发育受到影响，最终影响产量。
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