摘要
背景和目的： 结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，其远处转移倾向和较差的免疫应答是制约CRC临床疗效的主要障碍。5''外核苷酸酶(ecto-5''-nucleotidase，NT5E,又称CD73)是一种与腺苷生成相关的膜蛋白，据报道在多种癌症中升高;但其在CRC中的具体作用和机制尚未明确。 方法： 1.通过TCGA、GEO等公共数据库分析CD73的表达水平及与患者预后、TNM分期、DNA错配修复状态的相关性，通过Western blot(WB)、免疫组化(IHC)在临床样本中验证。 2.构建稳定过表达或干扰CD73的CRC细胞株，通过CCK-8细胞增殖实验、Transwell迁移实验、划痕愈合实验等探究CD73对CRC细胞恶性表型的影响;基于CRC患者队列进行信号通路富集分析，通过WB检测MAPK通路指标，使用CD73酶活性抑制剂APCP、MAPK通路抑制剂等进行挽救实验。 3.体外水平:收取对照和过表达CD73的CRC细胞培养上清(有/无添加5''AMP或A2AR抑制剂SCH58261)用于培养T细胞;体内水平:构建对照(NC)和干扰CD73(shCD73)的鼠源CRC细胞株MC38 NC/shCD73，分别构建C57BL/6小鼠皮下移植和盲肠原位移植模型。通过流式细胞术检测体内、外水平CD8+T细胞的增殖/浸润水平、凋亡水平和效应功能。 4.构建外源性表达卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)的MC38NC/shCD73细胞，进行C57BL/6小鼠盲肠原位移植;将体外OVA预激活的OT-1CD8+T细胞静脉注射到荷瘤小鼠体内，进行过继转移，检测抗原特异性T细胞效应功能。 5.构建C57BL/6小鼠皮下移植模型，探究CD73抑制剂与PD-1抑制剂是否具有协同抗肿瘤作用。 结果： 1.CD73在CRC中显著高表达，与患者的不良预后显著相关。 2.CRC中，CD73主要在肿瘤细胞中表达，通过激活MAPK信号通路增强肿瘤细胞的增殖和迁移能力，而不依赖于其产生的腺苷。 3.CRC中，肿瘤细胞主要表达A2B腺苷受体，T细胞主要表达A2A腺苷受体。 4.CRC细胞CD73产生的腺苷在体内外抑制CD8+T细胞的增殖和效应功能，促进CD8+T细胞的凋亡。 5.靶向肿瘤CD73可抑制小鼠CRC模型的肿瘤生长，增强CD8+T细胞的浸润、效应功能和对肿瘤新生抗原的应答。 6.抗CD73单抗或抗PD-1单抗单药治疗抑制CRC肿瘤进展，两者联用具有协同抗肿瘤作用。 结论： CD73在CRC中高表达，与患者不良预后呈显著正相关;在CRC细胞中通过MAPK信号通路促进增殖和迁移，并通过腺苷-A2A腺苷受体损害CD8+T细胞的活力和效应功能;靶向CD73可提高抗原特异性CD8+T细胞免疫应答。与单药治疗相比，CD73抑制剂和PD-1抑制剂联用治疗CRC显示出协同抗肿瘤作用。
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