摘要
布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌引起的全球范围的人畜共患病，对公共卫生和畜牧经济发展造成重大影响。巨噬细胞是布鲁氏菌的主要靶细胞之一，布鲁氏菌能够感染并持续存在于宿主细胞中，逃逸宿主巨噬细胞相关免疫应答以建立慢性感染。自噬是一种细胞自我保护机制，它可以清除衰老坏死的细胞器和入侵的病原体等物质，并对降解产物进行再加工，作为合成代谢途径的能量来源。而许多胞内病原体常常利用细胞的自噬机制，为自己在细胞内的生存创造有利环境。SIRT1作为宿主细胞中调节自噬等多种生物过程的保守蛋白，已被证明参与多种胞内病原体引起的宿主细胞自噬过程，SIRT1激活剂也表现出了治疗胞内寄生菌感染的潜力。因此，研究SIRT1在布鲁氏菌感染细胞中的作用对防治布鲁氏菌病具有重要意义。 本研究用B.abortus A19感染RAW264.7，利用Western blot、免疫荧光、实时荧光定量PCR等技术探究B.abortus A19感染对RAW264.7自噬以及宿主细胞SIRT1蛋白表达的影响；同时通过SIRT1干扰试验，并且使用自噬激活剂雷帕霉素和SIRT1激活剂白藜芦醇，探究SIRT1对B.abortus A19感染RAW264.7自噬过程的影响。试验结果如下： 1.SIRT1参与B.abortus A19诱导的RAW264.7自噬。Western blot和免疫荧光结果显示，B.abortus A19感染RAW264.7后48h LC3Ⅱ显著性上调（plt;0.05，plt;0.01），p62也显著性上调（plt;0.01，plt;0.01），Atg7在蛋白水平和mRNA水平上都显著下调（plt;0.05，plt;0.01），MDC法染色结果显示自噬小体数量增多，这些结果表明B.abortus A19诱导RAW264.7自噬的发生及自噬小体的产生；同时，溶酶体组织蛋白酶m-CTSB和m-CTSD在蛋白水平都显著性下调（plt;0.05，plt;0.05），表明B.abortus A19抑制细胞溶酶体的降解功能；Western blot和RT-qPCR结果显示，B.abortus A19感染RAW264.7后48h细胞SIRT1表达显著下调（plt;0.01，plt;0.05），用雷帕霉素处理后，细胞SIRT1表达有显著上调（plt;0.05），表明SIRT1参与B.abortus A19诱导的RAW264.7自噬。 2.SIRT1对B.abortus A19诱导的RAW264.7自噬有调控作用。SIRT1干扰试验结果显示，B.abortus A19+shSIRT1组LC3Ⅱ表达量显著增加（plt;0.05）；SIRT1激活剂显著减少了p62的积累（plt;0.05），并且显著增加了Atg7的表达（plt;0.01）和自噬小体的产生，并且显著提高了m-CTSB和m-CTSD的表达量（plt;0.05，plt;0.05），表明激活SIRT1进一步诱导了自噬水平，恢复了溶酶体的水解能力。 3.SIRT1对B.abortus A19诱导的RAW264.7自噬的调控作用有可能依赖于NAD+并且影响Ac-Foxo1水平。NAD+/NADH检测显示，B.abortus A19感染RAW264.7后48h NAD+水平显著下降（plt;0.01），使用SIRT1激活剂后，NAD+水平显著上升（plt;0.01）；Western blot结果显示，使用SIRT1激活剂后细胞内Ac-Foxo1水平显著下降，同时干扰SIRT1导致Ac-Foxo1显著上升（plt;0.05，plt;0.05）。 综上所述，本研究发现B.abortus A19感染诱导RAW264.7自噬的发生，阻碍了溶酶体的水解功能，SIRT1参与自噬过程且激活SIRT1进一步诱导了自噬并恢复了溶酶体的水解能力，这一过程有可能依赖于NAD+并且影响了Ac-Foxo1水平，本研究为探寻布鲁氏菌感染防控靶点提供新的理论依据。
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