摘要
背景与目的: 阿尔茨海默病（AD）是一种神经退行性疾病，其与载脂蛋白E（APOE）基因的关联已被广泛研究。然而，现有的检测方法存在一定的局限性，因此需要开发新的性价比高的检测方法来检测APOE基因型，以准确评估AD患者的患病风险。本研究旨在探索基于三螺旋分子开关（THMS）的DNA检测技术并结合侵袭反应，以提供一种快速、准确的检测APOE基因的单核苷酸多态性（SNP）的方法。 方法: 首先，根据APOE基因片段设计适配体THMS,并优化其合成条件。随后，通过THMS与常规分子信标（MB）体系的比较，评估THMS与靶序列的亲和力。接下来保持THMS长链的环状序列（适配体部分）不变，根据APOE基因片段，进一步优化THMS长链的茎部和短链，之后加入靶序列与THMS结合，诱导其构象变化，并在靶序列SNP位点处形成三碱基重叠的结构，进而被瓣状核酸内切酶1（FEN1）识别并切割。通过观察荧光信号的变化，判断靶序列是否存在SNP位点。最后，将该方法应用于临床样本中，验证其在APOE基因多态性检测中的可行性和准确性。 结果: 1:基于荧光能量共振转移原理成功合成了基于APOE ε4序列的适配体THMS。对比了 THMS体系与MB体系的检测限，THMS的检测限为0.987 nM,线性范围是1nM至200nM,而MB的检测限为12.349 nM,线性范围是60 nM至480nM。结果表明THMS的检测限比MB的检测限更低，即THMS比MB具有与靶序列更高的亲和力。 2:建立了基于靶序列激活的THMS-构象变化诱导侵袭反应对APOEε4进行SNP检测的方法。该方法在靶序列非扩增的情况下，检测限低至0.27 nM。本实验设计对完全匹配和单碱基错配的单链进行了很好的区分，从而有效地避免了假阳性结果。我们还根据荧光信号的差异实现了基因分型，并成功地将这一策略应用于临床样本中APOE基因多态性的检测中。 结论: 本研究基于THMS技术提出了一种新的方法，可用于非扩增情况下的阿尔茨海默病APOE单核苷酸多态性检测。这一方法具有高度的特异性和准确性，有望为临床阿尔茨海默病的诊断和治疗提供新的思路和策略，有助于实现精准医疗，提高医疗效能。
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