摘要
猫疱疹病毒 Ⅰ 型（ Felid Herpesvirus 1 ， FHV-1 ）是猫病毒性鼻气管炎（ Feline Viral Rhinotracheitis，FVR）的致病原，可引起猫的眼部和上呼吸道疾病，在世界范围内广泛流行，严重危害猫科动物的健康。临床上，对于 FHV-1 的防控，主要依靠疫苗接种，但现有疫苗不能防止病毒的再次激活，且免疫保护力有限；此外，目前还没有抗 FHV-1 的特异性治疗药物。因此，急需研究出一种针对 FHV-1 的特异性治疗药物。 纳米抗体具有体积小、亲和力高、免疫原性低、组织渗透性强等特征，在疾病的治疗中被广泛应用。因此，本研究首先进行 FHV-1 临床毒株的分离与鉴定，使用FHV-1全病毒免疫双峰驼，筛选FHV-1特异性纳米抗体，鉴定FHV-1特异性纳米抗体的亲和力和中和活性，并进行初步的机制研究。主要研究结果如下： 1. FHV-1临床毒株的分离与鉴定 采集临床病料，利用血清中和试验对FHV-1进行分离。通过荧光定量PCR、病毒形态学、生长动力学、同源性分析以及遗传进化分析等试验，对分离毒株进行鉴定。结果显示，临床病料为 FHV-1 和 FCV混合感染，用 FCV阳性血清中和其中的 FCV，经PCR、RT-PCR检测结果为FHV-1阳性，FCV阴性；将血清中和后的病毒液接种CRFK细胞出现圆缩、葡萄串聚集等细胞病变，表明分离到FHV-1临床株，并将其命名为F2023SX1；经氯化铯密度梯度离心得到纯化的FHV-1病毒粒子，通过透射电镜观察到球形、有囊膜、直径150 nm左右的病毒粒子，符合FHV-1形态特征。病毒生长动力曲线测定显示，分离株感染细胞后，上清中病毒滴度呈现先上升后下降最后趋于平稳的趋势，病毒滴度在接种48 h时最高。采用PCR扩增分离株的gD基因，通过同源性和系统发育树分析，F2023SX1 株与国内外 FHV-1 流行毒株同源性 100%。 2. FHV-1特异性纳米抗体的淘选 将纯化的FHV-1病毒粒子免疫双峰驼，5次免疫后，采集外周血并分离淋巴细胞，提取淋巴细胞总RNA并反转录为cDNA。通过巢氏PCR扩增VHH片段，将其连接到pMECS噬菌体展示载体上，构建了抗FHV-1噬菌体展示文库。经过三轮淘选与富集，通过ELISA筛选FHV-1特异性纳米抗体。结果显示，VHH基因片段大小为400 bp，构建的FHV-1噬菌体展示文库库容为6.5×107个转化子，阳性率为96.5%；共筛选获得8株FHV-1特异性纳米抗体，分别命名为FHV-Nb10、-17、-23、-31、-35、-56、-57、-66。 3. FHV-1特异性纳米抗体中和活性分析 首先构建 pCMV-FHV-Nbs-HRP真核表达载体，转染 HEK-293T细胞，通过 IFA、Western blot方法鉴定FHV-Nbs-HRP融合蛋白的分泌表达，再通过ELISA鉴定特异性纳米抗体与FHV-1的亲和力。随后，构建FHV-1特异性纳米抗体原核表达载体，经诱导表达、纯化与透析，通过ELISA、IFA等试验鉴定特异性纳米抗体与FHV-1的亲和力，利用Co-IP方法初步鉴定纳米抗体与FHV-1蛋白的结合；最后制备抗FHV-1兔多克隆血清，并通过IFA初步验证纳米抗体的中和活性。结果显示，8株pCMV-FHV-Nbs-HRP真核表达载体均成功构建并分泌表达，其中FHV-Nb17、-31、-35、-66纳米抗体亲和力较好。成功构建4株pET32a-FHV-Nbs原核表达载体，并获得纯化的纳米抗体，且对FHV-1具有较高的亲和力。另外，FHV-Nb17可能与FHV-1 gK结合，FHV-Nb31、-35可能与FHV-1 gB结合。抗FHV-1兔多克隆血清的效价为1:106，能与FHV-1临床毒株发生特异性反应。但是，4株纳米抗体对FHV-1没有明显的中和活性。 综上所述，本研究成功分离并鉴定了1株FHV-1临床毒株，将纯化的FHV-1免疫双峰驼，构建了抗FHV-1特异性噬菌体展示文库，获得了8株FHV-1特异性纳米抗体，筛选出4株与FHV-1亲和力较高的纳米抗体，初步鉴定出可能与纳米抗体结合的病毒蛋白，但是4株纳米抗体均没有明显的中和活性。本研究为FVR治疗药物的研发提供了技术参考和生物材料。
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