摘要
苹果汁是我国重要的果汁消费品，展青霉素（4-羟基-4-氢-呋喃（3,2-碳）骈吡喃-2（6-氢）酮，Patulin）是一种不饱和内酯类真菌毒素，具有水溶性和热稳定性，容易污染苹果汁的加工过程。展青霉素对植物和动物具有广泛的毒性，其污染不仅会对产品品质造成极大的影响，而且严重威胁食品安全和人体健康。现有的去除方法中，生物酶是一种较为理想的展青霉素解毒剂。然而，游离酶往往存在稳定性差、一次性使用、难以分离和回收等缺点，这些问题限制了酶解毒剂的应用。对酶进行固定化可以在很大程度上改善这些问题，合适的固定化方式可以提高酶的稳定性、延长酶的使用寿命并使酶易于回收和重复使用。基于此，本研究聚焦于展青霉素降解酶，从四种生物酶中筛选出了一种对展青霉素降解效果最好的猪肝酯酶，并以磁性纤维素纳米晶为载体对猪肝酯酶进行了固定，成功制备了能够有效降解苹果汁中展青霉素的固定化酶。主要研究内容和结果如下： （1）苹果汁中展青霉素降解酶的筛选及降解产物解析。选取了四种生物酶，即猪肝酯酶（PLE）、辣根过氧化物酶（HRP）、黑曲霉脂肪酶 A（LA）和爪哇毛霉脂肪酶 M（LM），并测定了它们对苹果汁中展青霉素的降解率。在实验条件下，PLE、HRP、LA 和 LM 对苹果汁中展青霉素的降解率分别可达 97.8%、53.2%、76.3%和68.2%。因此，选择了猪肝酯酶制备后续的固定化酶。评价了四种酶处理对苹果汁品质的影响。四种酶的使用均会导致果汁产生轻微的褐变，PLE 会显著降低苹果汁的澄清度，但四种酶对苹果汁质量的影响总体在可接受的范围内。随后通过液相色谱质谱联用法分析了四种酶降解展青霉素的产物，讨论了可能的展青霉素降解机制和毒性变化。结果显示，PLE、HRP 对展青霉素的降解可能涉及内酯键的水解，降解产物为Desoxypatulinic acid（DPA）。而 LA和 LM对展青霉素的降解可能破环了展青霉素的半缩醛结构，降解产物为Hydroascladiol。 （2）固定化酶（PLE@MNCC）的制备、表征及安全性评价。采用硫酸水解获得了纤维素纳米晶，随后通过共沉淀-静电自组装法制备了磁性纤维素纳米晶（MNCC）载体。使用戊二醛作为交联剂对猪肝酯酶进行了固定化并对反应条件进行了优化。最佳固定化条件为：载酶比10:16、交联剂浓度60 mM、交联时间8 h。在该条件下，载酶量可达808.38 mg/g MNCC、酶活性回收率为45.16%。通过X-射线衍射、扫描电镜、透射电镜、傅里叶变换红外光谱、X-射线光电子能谱等技术表征了 PLE@MNCC的成功制备。通过细胞毒性评价测定了MNCC及PLE@MNCC的安全性，载体和固定化酶均表现出了良好的生物相容性。 （3）固定化酶对苹果汁中展青霉素的解毒性能及应用评价。探究了PLE@MNCC对展青霉素的解毒效果，其对苹果汁中展青霉素的解毒率可达 80%以上。PLE@MNCC 可通过生物降解和吸附两种方式有效解毒被展青霉素污染的苹果汁，其中生物降解是主要的解毒方式。PLE@MNCC 可以在使用后分离和回收，与游离酶相比，PLE@MNCC 具有更好的储存稳定性和可重复使用性。在重复使用 8 次以后，固定化酶仍能保留约 50%的初始活性。同时，PLE@MNCC 的使用对苹果汁质量没有明显的负面影响。此外，细胞毒性评估的结果表明，与展青霉素相比其降解产物的毒性大大降低。 本研究主要筛选获得了能够有效降解苹果汁中展青霉素的猪肝酯酶，并以纤维素基磁性纳米材料为载体对其进行了固定化，系统分析了固定化酶的形貌和结构，评价了其在苹果汁中应用的稳定性与安全性，证明了其在果汁中的应用潜力。该固定化酶可成为一种稳定、安全、可分离回收和重复使用的展青霉素解毒剂。
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