摘要
赭曲霉毒素 A（OTA）是一类主要由赭曲霉（Aspergiltus Ochratoxin)、硫色曲霉（Aspergiltus sulphureus）以及纯绿青霉（Penicillium verrucosum）等霉菌产生的次级代谢产物，具有肝毒性、肾毒性、免疫毒性以及致畸性。作为葡萄加工生产和国际贸易中重要的质量安全因子之一，OTA污染威胁了葡萄酒加工业的健康快速发展，减少葡萄制品中 OTA污染十分重要。本文通过对 10种不同酶的评价，筛选获得了能够高效降解葡萄酒和葡萄汁中 OTA，且对葡萄制品品质影响较小的酶；在此基础上，开发了一种新型酶固定化载体，实现了酶的高效固定化，探究了固定化酶的活性、稳定性、OTA 去除能力、安全性及对葡萄酒品质的影响，为控制 OTA 提供了技术支持。主要研究内容和结果如下： （1）通过对10种酶 OTA降解能力评价，筛选获得了可以高效降解 OTA的酶，并对其降解路径及降解产物的安全性进行了解析。研究结果表明：10种酶中有7种酶在缓冲液中具有降解OTA的能力。其中，羧肽酶A（CPA）（100%）、脂肪酶（100%）、胰酶（75.72%）和羧肽酶 B（73.45%）能有效降解 OTA。在葡萄制品中，胰酶（53.24%）和CPA（61.56%）在37℃时达到最大OTA降解率。LC-MS/MS分析结果进一步表明，在这三种酶（CPA、脂肪酶和胰酶）的处理下，OTA 被降解生成了无毒的赭曲霉毒素α和苯丙氨酸。此外，胰酶和CPA对葡萄酒和葡萄汁具有澄清作用，且对葡萄酒和葡萄汁中的有机酸和风味成分影响较小。因此，胰酶和CPA可应用于葡萄酒和葡萄汁中，有效降解OTA。 （2）通过固定化酶载体的设计合成和固定化条件的优化，成功制备了固定化酶。利用扫描电子显微镜、透射电子显微镜、傅里叶转换红外光谱、X 射线衍射以及元素映射等分析手段对固定化过程进行了表征，并通过测定固定化酶在不同条件下（如不同 pH、温度等）的酶活性来评估其性能。研究结果表明，胰酶成功固定在载体上，形成了聚多巴胺功能化磁性多孔壳聚糖固定化胰酶（MPCTS@PDA@胰酶）。在最佳固定化条件下（超声处理40 min、20℃、5 mg/mL胰酶），固定化酶量和酶相对活性率分别达到94 mg/g和87%。相较于游离胰酶，MPCTS@PDA@胰酶展现出更广泛的pH稳定性和较高的耐热性。在存储稳定性方面，该固定化酶在 4℃ 和 25℃ 下均表现出色，存储21天后相对活性分别为94%和47%，凸显出长期存储优势。 （3）研究评估了MPCTS@PDA@胰酶去除葡萄酒中OTA的效果，并通过检测处理前后葡萄酒样品的澄清度、有机酸和香气成分等，考察了其对葡萄酒品质的影响。此外，采用体外细胞毒性实验评价了固定化酶对人体细胞的潜在风险，验证了MPCTS@PDA@胰酶在葡萄酒中应用的安全性和可行性。研究结果表明，MPCTS@PDA@胰酶通过吸附和降解协同去除葡萄酒中 OTA（超过 58%）。此外， MPCTS@PDA@胰酶在8次循环使用后保持了43%的初始活性。经过MPCTS@PDA@胰酶处理后，葡萄酒变得更明亮、更绿和更蓝。MPCTS@PDA@胰酶对葡萄酒的香气成分和可溶性固形物含量影响微乎其微，最大限度地保持了葡萄酒的原有品质。此外，它在浓度低于100 μg/mL时没有表现出细胞毒性。这些结果表明，MPCTS@PDA@胰酶可作为一种高效的酶制剂用于葡萄酒中OTA的解毒。
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