摘要
痘病毒（Poxvirus）是成员数量最多、基因组最大和宿主范围最广的一类动物病毒，大部分的痘病毒都能引起动物源性的人兽共患病。痘病毒主要包括羊痘、猴痘和羊口疮病毒等，对全球的公共卫生安全造成了严重威胁。羊传染性脓疱病毒又称羊口疮病毒（Orf virus, ORFV），属痘病毒科、副痘病毒属，主要侵害羔羊，以口腔和唇部形成脓疱为主要特征，影响羔羊的采食过程，降低其免疫力，甚者引起死亡。ORFV对养殖业带来了巨大的经济损失，严重制约了农业的健康发展。迄今为止，关于ORFV的防控工作仍然只停留在传统的疫苗接种和常规药物治疗层面，但是ORFV在长期的遗传进化过程中病毒不断发生基因组变异，加大了羊口疮疾病的防治难度。因此，在全基因组层面系统地筛选与ORFV互作的宿主因子，对治疗和防控ORFV感染有重大意义。 常用的遗传筛选方法有转录组测序、蛋白质组测序和代谢组测序等，但这些测序技术具有获得的基因数量庞大且分析过程复杂等局限性，不利于筛选关键基因等工作。因此，亟需在功能基因的筛选方法上进行创新。CRISPR/Cas9文库筛选技术具有高精确度、多靶点和简便易行等优势，能够全面挖掘潜在的病毒抗性靶点基因。目前，该技术在病毒领域得到广泛应用，并筛选到多个与病毒互作的关键宿主基因，足以证明CRISPR/Cas9 筛选技术的可靠性。因此，基于 CRISPR 全基因组敲除文库的筛选策略，发掘与ORFV病毒互作的关键宿主因子，进而阐明病毒感染宿主的作用机制，能够促进羊的抗病育种工作。 本研究采用CRISPR/Cas9文库筛选技术，构建了绵羊全基因组敲除文库筛选平台，通过 ORFV 病毒侵染，筛选并分析了与 ORFV 病毒复制相关的候选宿主因子。本研究主要过程及取得的成果如下： （1）STIC细胞病毒侵染模型的构建 绵羊睾丸间质细胞（sheep testicular interstitial cells，STIC）是羊口疮病毒侵染的最佳细胞模型之一。为确定永生化的绵羊睾丸间质细胞是否适合作为文库筛选细胞模型，分别通过EdU染色、荧光定量、细胞病变（cytopathic effect，CPE）观察和透射电镜等试验进行验证。结果表明，STIC细胞具有较强的增殖活力，STIC细胞在感染羊口疮病毒后会出现明显的细胞病变，具有致死表型。同时，STIC细胞支持ORFV病毒在细胞内完成整个病毒生命周期，符合作为病毒感染细胞模型的要求。 （2）绵羊全基因组敲除文库的构建 本研究构建了靶向绵羊全基因组蛋白质编码的 77,664 条 sgRNA 的敲除质粒文库（Sheep Genome-wide CRISPR Knockout Pooled Library, SheepGeCKO）。通过慢病毒包装建立了稳定表达Cas9蛋白的STIC细胞系，并利用针对TYW5基因的sgRNA验证稳转细胞系中Cas9蛋白的切割效率。结果显示，Cas9蛋白具有切割活性，即STIC-Cas9细胞系可以稳定表达 Cas9 蛋白。随后，用慢病毒包装的敲除质粒文库侵染 STIC-Cas9稳转细胞系，得到sgRNA覆盖率在95%以上的突变体细胞库。 （3）利用绵羊全基因组敲除文库获得ORFV感染相关的候选因子 利用ORFV病毒对敲除细胞库进行感染，设置4组平行实验，分别收集实验组和对照组的存活细胞送深度靶向测序，并对筛选得到的差异基因进行 GO 分析和 KEGG 富集分析。KEGG富集分析显示，差异基因主要涉及氧化磷酸化、神经性变性、甘油磷脂代谢和错配修复信号通路等。GO分析显示，差异基因主要参与的生物过程包括线粒体ATP合成、氧化磷酸化、细胞呼吸、B淋巴细胞的分化和线粒体电子传递等过程；主要涉及的细胞成分包括线粒体呼吸链、呼吸链复合物I、纤毛、对称突触和囊泡膜等。 综上所述，本研究分别通过构建绵羊全基因组敲除质粒文库、稳定表达 Cas9 蛋白的STIC细胞、sgRNA慢病毒文库和全基因组敲除细胞库，成功构建了绵羊全基因组敲除文库筛选平台。利用ORFV对绵羊全基因组敲除细胞库进行侵染，初步筛选并分析得到 ORFV 增殖相关的候选宿主因子。本研究对于初步发现新的抗 ORFV 靶点和后续研究ORFV致病机制奠定了理论基础，同时，也有利于推动新型生物技术抗病育种工作的发展。
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