摘要
小麦（Triticum aestivum）是世界三大主粮之一，也是全球第二大供人类食用的谷物，小麦产量的稳定及增长在世界各地都备受关注，繁育具有优良农艺性状的小麦是每一位致力于小麦研究的农业科学家持之以恒的努力方向。在小麦育种方面， CRISPR 技术因其高效性和简便性迅速成为了世界各地农业科研工作者的有利工具。目前较为传统和成熟的 CRISPR 技术包括农杆菌转化法、粒子轰击法和原生质体转染法；因其较好的基因编辑效果，被众多农业科学家所青睐。但这些方法都需要费时费力的组织培养的过程，因此逐渐被不断开发的新型基因编辑系统所取代。在这些新型基因编辑系统中，其中基于大麦条纹花叶病毒（BSMV-Barley Stripe Mosaic Virus）的基因编辑试剂递送系统因其不需要组织培养过程便可获得稳定遗传的后代而备受瞩目，但是目前该递送系统在编辑效率、系统稳定性等方面尚存在一些问题，限制了其在普通实验室的广泛应用。本研究以小麦自噬蛋白编码基因TaAtg8为研究对象，通过病毒载体改造、农杆菌侵染及小麦转染条件优化等途径，对基于BSMV病毒递送系统的小麦基因编辑体系进行了优化，旨在推动实用的小麦基因敲除突变体创制系统的快速发展。取得的主要研究结果如下： （1）病毒递送载体的改造：BSMV载体分为三组分，分别为 BSMV-α、BSMV-β和BSMV-γ。pCB1301-SmR是本室冻存的原始载体，属于BSMV-γ部分载体。本试验首先通过对靶标基因进行生物信息学分析并设计了四个可以靶向目的基因的 sgRNAs，然后利用 SapI 酶酶切pCB1301-SmR载体，再借助T4连接酶使带有gRNA scaffold的线性化载体与 sgRNAs 进行连接，完成对该载体“SmR”片段的精准替换，并将改造后的新载体命名为BSMVγ-sgRNAs。然后经过转化大肠杆菌感受态和Sanger测序，确定改造的基因编辑载体正确，该新载体能够递送sgRNAs到小麦中并发挥作用。 （2）农杆菌侵染烟草的体系优化探究：在病毒载体侵染小麦之前，我们以烟草为中间媒介，探究最适的农杆菌注射浓度以培养更好的感病叶片来侵染小麦。TaAtg8基因在小麦 A、B、D 三个亚染色体上都有等位基因，因此本研究设计了靶向不同亚染色体基因的 sgRNAs，在注射烟草试验中对不同组合方式的靶点注射烟草情况进行研究。首先控制农杆菌浓度一致，然后分组将 sgRNAs 递送至烟草体内。由于靶点靶向问题，本研究设置了以下组合：①BSMV-α、BSMV-β、BSMVγ-ABD（此时BSMVγ-ABD 同时靶向目标基因的三个亚染色体）；②BSMV-α、BSMV-β、BSMVγ-AB1、BSMVγ-2D（此时BSMVγ-AB1靶向A和B亚染色体，BSMVγ-2D靶向D染色体；二者共同靶向三个亚染色体）和③BSMV-α、BSMV-β、BSMVγ-AB2、BSMVγ-2D（此时BSMVγ-AB2靶向A和B亚染色体，BSMVγ-2D靶向D染色体；二者共同靶向三个亚染色体）。结果表明，在同一OD600值下，仅从烟草的感病状态来看，②和③的组合方式注射烟草效果要优于组合①。然后又对同一组合方式在不同 OD600值下注射烟草情况进行研究，结合相关文献以及本室前期研究设置 OD600值为 0.3、0.6、0.9 的浓度梯度（以 α、β 为基准）分别将以上组合方式转染烟草，其中组合①中BSMVγ-ABD 的农杆菌浓度始终与 α、β 的浓度一致；组合②和③中 BSMVγ-AB1、BSMVγ-AB2和BSMVγ-2D的农杆菌浓度为α、β浓度的一半。结果表明，在同一组合方式下，当OD600值为0.9时，各注射叶片的感病状态都要比0.3和0.6时要好。 （3）基因编辑材料的创制：对于上述感病的叶片，添加磷酸钠（加入 5%亚硫酸钠）缓冲液并对其进行研磨处理，然后用物理摩擦方式接种可以表达 Cas9 的拔节期Bobwhite-cas9+小麦叶片，以此来获得 TaAtg8 基因缺失表达的小麦突变体材料。结果表明在目标基因的 A 和 B 亚染色体上引起一个碱基的突变，此突变碱基恰好在 XbaI位点处。于是扩增该靶点条带上下游大约200 bp，又用XbaI酶尝试酶切；结果和预期一样，XbaI 酶并未识别此位点，此条带未被切开，表明此位点的碱基确实被替换了。这意味着该递送系统在普通实验室也可以作为小麦基因编辑体系来创制突变体材料。 综上所述，本研究以小麦 TaAtg8 基因为切入点，对基于 BSMV 病毒诱导的基因编辑线路进行优化，整理得到一套较为实用的基因编辑体系，并得到一株可能被成功编辑的材料。该递送体系目前仍存在一些问题，但本文为后续提升基因编辑效率研究和小麦分子育种提供一定的参考和技术支持。
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