摘要
棉花是我国重要的经济作物。中国是世界上最大的原棉生产国和消费国，棉花在国民经济中占有重要的地位。转基因技术在棉花生物育种中举足轻重，但能否建立高效棉花体胚再生体系是制约该技术能否成功实施的关键。应用农杆菌介导的体胚再生遗传转化法是功能基因组学研究和分子育种的主要方法，但受体基因型限制、转化周期较长等不足限制了该技术在基因工程以及功能基因组学研究中的应用。缩短遗传转化时间、破除受体基因型限制，是农杆菌介导体胚再生遗传转化法亟待解决的问题。前人研究发现，TaWOX5基因过表达不仅显著提高了小麦的遗传转化效率，也提高了小黑麦、黑麦、大麦和玉米的遗传转化效率。基于此，本论文以TaWOX5（TriticumaestivumWUS-RELATEDHOMEOBOX5）基因为基础，探究提高棉花体胚再生以及突破基因型限制的遗传转化方法。以陆地棉(Gossypiumhirsutum)WC为试验材料，开展了依托TaWOX5基因建立高效棉花体胚再生体系的工作，获得的主要研究结果如下： 1.红蓝光（1﹕1）处理促进了愈伤组织中增殖再生相关基因的表达，提高了CAT酶活性，并使其ROS水平相对较低，最终促进愈伤组织的诱导和增殖，优化了遗传转化的组培条件。 2.TaWOX5基因过表达促进了棉花体胚再生，过表达茎段在试验7、15、25天时的重量显著大于对照，表现为下胚轴愈伤横切面明显增大，愈伤组织的分裂更加旺盛，细胞数目更多，说明了TaWOX5基因能够促进棉花愈伤的生长。检测外源TaWOX5与内源GhWOX5基因在3个过表达株系中的表达量，发现过表达植株及愈伤中外源TaWOX5与内源GhWOX5基因的表达量均明显高于对照WOX5基因的过表达促进了转基因愈伤的增殖和分化，导致其体胚比对照提前两个月出现，而且体胚发生率高达65%。 3.构建了过表达TaWOX5并敲除GI基因的编辑载体CRISPR-Cas9+TaWOX5，以pCAM2300为对照，通过农杆菌介导法转入陆地棉WC，统计发现转化CRISPR-Cas9+TaWOX5载体的棉花与对照提前两个月出现体胚，而且体胚数量达53个，体胚发生率为37.5%，相比对照仅出现7个体胚、体胚发生率6%大大提高。在随机挑选的24个转化CRISPR-Cas9+WOX5载体的愈伤体胚中共检出阳性体胚21个，阳性率为87.5%，且阳性体胚的GI基因存在2处或2处以上碱基的替换及缺失，表明GI基因已被编辑。现已获得两株转基因棉花幼苗。
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