摘要
目的：食管鳞状细胞癌（EsophagealSquamousCellCarcinoma，ESCC）是一种严重威胁我国居民生命健康的恶性消化道肿瘤。全基因组关联研究（Genome-WideAssociationStudy，GWAS）已经在中国人群中鉴定出超过14个的食管鳞癌易感位点，但仍有大量的位点及其潜在的生物学作用机制未被阐明。N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）是一种常见的RNA修饰类型，已被证明与肿瘤的发生和发展密切相关。遗传变异可能通过影响RNA的m6A修饰水平改变基因的表达，进而影响肿瘤的进展。本研究旨在挖掘通过影响m6A修饰进而影响中国人群食管鳞癌易感性的遗传变异，为阐明遗传变异在食管鳞癌中的作用提供更多的线索。 方法：本研究首先利用m6A修饰相关遗传变异数据库RMVar，完整获取可能影响m6A修饰的遗传变异，结合食管鳞癌GWAS数据，筛选出可能通过影响m6A修饰进而影响食管鳞癌易感性的遗传位点。发现阶段样本数据来源于两项中国人群食管鳞癌研究，人群分别来自北京地区和山西、河南地区，共包括3929例病例和4144名对照。接着采用两阶段独立中国人群验证发现阶段鉴定的潜在易感位点与食管鳞癌易感性间的关联。第一阶段样本来自武汉地区，包括3089例病例和3919名对照。第二阶段样本来自河北地区，包括3850例病例和4838名对照。采用Logistic回归模型评估遗传变异与食管鳞癌发生风险之间的关联。进一步对发现的易感位点开展生物学功能探索，利用表达数量性状位点（expressionQuantitativeTraitLoci，eQTL）和基因共表达等多种生物信息学分析策略探索其可能的作用机制。基因表达数据获取自UCSCXena数据库，eQTL信息获取自GTEx数据库。再开展功能实验以阐明其影响食管鳞癌易感性的生物学机制。主要包括构建以pmirGLO为载体的重组质粒开展双荧光素酶报告基因实验，探究该位点对其所在基因MLXIPL表达水平的影响，并通过细胞增殖实验检测基因MLXIPL对食管鳞癌细胞增殖能力的影响。 结果：1.本研究从RMVar获取了1401814个m6A修饰相关遗传变异，结合两项中国人群的食管鳞癌GWAS数据，发现1371个遗传变异与食管鳞癌之间的易感性显著相关（P＜0.05）。其中，关联最显著的遗传位点是位于基因MLXIPL3’端非翻译区（3’UntranslatedRegion，3’UTR）的rs1051921（OR=1.27，95%CI=1.16-1.40，P=2.33×10-7）。随后，对上述1371个位点所在的1228个基因进行富集分析，结果显示m6A修饰相关遗传变异所在的基因显著富集于肿瘤进展相关的多条通路中，提示其在食管鳞癌发生发展过程中可能发挥着重要作用。 2.MLXIPLrs1051921（C＞T）与中国人群食管鳞癌易感性之间的显著关联在两阶段独立人群中均得到验证（第一阶段：OR=1.36，95%CI=1.23-1.51，P=3.08×10-9；第二阶段：OR=1.36，95%CI=1.25-1.49，P=8.51×10-12）。合并全部中国人群病例对照数据的关联分析结果显示，rs1051921C＞T突变显著升高了食管鳞癌的发生风险（OR=1.34，95%CI=1.27-1.41，P=2.30×10-26）。 3.生物信息学分析显示rs1051921C＞T突变可能影响其所在基因MLXIPLmRNA的m6A修饰水平，eQTL分析表明该位点[T]等位基因型与食管黏膜组织MLXIPL的高表达相关（P=1.3×10-14）。并且在食管黏膜组织中，共表达分析结果显示MLXIPL与m6A修饰相关基因METTL3和IGF2BP2的表达水平均呈显著的正相关关系（METTL3：r=0.34，P=6.31×10-9；IGF2BP2：r=0.44，P=2.27×10-14）。 4.双荧光素酶报告基因实验表明rs1051921C＞T突变通过影响m6A修饰相关因子METTL3和IGF2BP2介导的m6A修饰过程，促进其所在基因MLXIPL的表达。体外细胞增殖实验证明敲降基因MLXIPL能够显著抑制食管鳞癌细胞的增殖能力。 结论：本研究从影响m6A修饰水平的遗传变异角度，运用分子流行病学和分子生物学研究方法，发现m6A修饰相关遗传变异rs1051921与食管鳞癌易感性显著相关。进一步结合生物信息学方法预测rs1051921潜在的作用机制，并利用功能实验证明rs1051921通过影响m6A修饰相关酶METTL3和IGF2BP2介导的m6A修饰过程，上调促癌基因MLXIPL的m6A修饰水平促进其表达，最终增加食管鳞癌的发生风险。上述结果可为阐明食管鳞癌的发生机制和识别高危人群提供重要的科学依据。
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