摘要
天然的黑豆多肽具有抑制 α-葡萄糖苷酶活性的潜在活力，兼有安全、低毒、易吸收的特征，具有调控和降低Ⅱ型糖尿病患者餐后血糖水平的潜力。本研究筛选出了碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶两级酶解黑豆蛋白制备 α-葡萄糖苷酶抑制肽的最优酶解时间，采用生物亲和超滤联合LC-MS/MS、BIOPEP、PeptideRanker和分子模拟对接技术从酶解液中快速筛选出了潜在的 α-葡萄糖苷酶抑制肽。通过酶动力学、光谱学、热力学、原子力显微镜等方式探究了Top 3 肽与 α-葡萄糖苷酶的作用机制。通过蔗糖和淀粉负荷试验评价了Top 3 肽在小鼠体内的降糖活性。通过动物模型试验研究了 α-葡萄糖苷酶抑制活性最强肽对Ⅱ型糖尿病小鼠的综合治疗效果，探索了其在小鼠体内的降糖机制。研究结果如下： (1) 碱性蛋白酶酶解黑豆蛋白 4 h 时水解产物对 α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，为61.01±1.98%，黑豆蛋白水解度为25.21±0.79%。碱性蛋白酶解物经木瓜蛋白酶二级酶解3 h时，其水解产物对α-葡萄糖苷酶的抑制率达到最高，为68.18±1.14%，黑豆蛋白水解度为37.48±1.48%。 (2) 采用生物亲和超滤联合 LC-MS/MS 从黑豆蛋白二级酶解液中分离鉴定出 242条潜在α-葡萄糖苷酶抑制肽。采用BIOPEP数据库和PeptideRanker人工智能软件（AI）分别从242条肽中快速筛选出Top 10α-葡萄糖苷酶抑制肽，将其与α-葡萄糖苷酶进行分子对接，筛选出Top 3 α-葡萄糖苷酶抑制肽，序列分别为NNNPFKF、RADLPGVK和FLKEAFGV。 (3) NNNPFKF、RADLPGVK 和 FLKEAFGV 对 α-葡萄糖苷酶的 IC50值依次为1.323±0.089 mg/mL、2.829±0.025 mg/mL、4.202±0.109 mg/mL，实际抑制活性与分子对接的排序相反，可能是由于分子对接中筛选策略的缺陷。三条肽实际活性顺序与我们计算的疏水性强弱顺序一致。因此，疏水性指数未来应作为AI软件筛选α-葡萄糖苷酶抑制肽的标准。 (4) Top 3肽与α-葡萄糖苷酶结合是一种自发的、不可逆的吸热反应。多肽的N-H基团与酶的C=O基团以氢键方式结合，破坏了α-葡萄糖苷酶的二级结构，导致其活性下降。肽对酶的抑制机制表现为混合竞争型和剂量依赖型。肽对酶抑制活性由弱到强可通过原子力显微镜观察两者形成复合物的点状、链状或网状聚集图像来评价。FLKEAFGV和RADLPVK能够显著降低小鼠餐后血糖，与临床用药阿卡波糖的降糖效果相当。 (5) FLKEAFGV和阿卡波糖在30 mg/kg·bw剂量时能够抑制Ⅱ型糖尿病小鼠α-葡萄糖苷酶的活性，分别为13019.88±1199.82 U/g和18742.59±1332.50 U/g，显著低于空白对照组32671.82±1035.65 U/g (plt;0.05)。FLKEAFGV治疗Ⅱ型糖尿病小鼠4周，使小鼠体内总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、糖化白蛋白、ROS 及MDA含量下降，糖原含量、胰岛素含量、SOD与CAT活性增强。与阿卡波糖不同的是，FLKEAFGV能改善Ⅱ型糖尿病小鼠的胰岛细胞充血、胰岛外分泌部边界浸润，肾小球损伤、肝组织结构扭曲等病理状态。 综上所述，BIOPEP数据库、PeptideRanker和分子对接三AI工具联合生物亲和超滤耦合LC-MS/MS技术是一项高效、快速筛选α-葡萄糖苷酶抑制肽的方法。研究结果证实了所筛选的FLKEAFGV不仅具有替代阿卡波糖降低餐后血糖的潜力，而且具有提高胰岛素水平、促进糖尿病患者糖原合成，改善血脂代谢紊乱的多重有益功能，具有降血糖功能食品和药物开发的潜力。
NETL