摘要
恶性肿瘤作为一种引发全世界关注的重大公共卫生安全问题，引发了抗肿瘤药物开发研究的热潮。尽管癌症涉及一系列与癌基因激活和肿瘤抑制相关的转化的多步骤过程，但目前已知表观遗传失调程度影响癌症的起始和进展以及肿瘤的可塑性和异质性，在癌症发展的表观遗传失调事件中，组蛋白去乙酰化酶（Histonedeacetylase，HDAC）的功能失调和蛋白质乙酰化水平的相关修饰程度影响癌细胞的恶性程度。因此在表观遗传调控领域，HDAC已被设计和开发成为多种癌症和其他人类疾病候选药物的重要治疗靶点。HDAC抑制剂诱导靶蛋白内组蛋白高乙酰化，改变细胞周期和增殖、细胞分化和细胞死亡程序的调节，由此HDAC抑制剂成为了一种很有前途的抗肿瘤药物。本研究在HDAC抑制剂经典药效团模型的基础上，通过修Cap基团设计了20个化合物，并通过抗增殖实验和酶抑制实验对目标化合物的生物活性进行了评价。此外，通过分子动力学模拟方法进一步探索了高活性化合物对HDAC1和HDAC6作用机制，阐明了选择性抑制作用的分子基础，为发现新型HDAC抑制剂提供了有价值的数据。 第一部分HDAC抑制剂的设计与初步体外生物活性评价 目的：比较系列化合物对不同肿瘤细胞增殖作用的影响以及对HDAC酶抑制活性，筛选体外抗肿瘤活性好的化合物，进一步研究HDAC1、HDAC6酶选择性，找到抗肿瘤活性强、选择性高、新结构分子。 方法：利用计算辅助药物设计（ComputerAidedDrugDesign，CADD）确定抗肿瘤化合物的活性优势片段，在HDAC抑制剂经典药效团模型的基础上进行改进，修饰Cap基团，共设计两类20种化合物，以HDAC6选择性抑制剂TubastatinA（TBSA）和HDAC广谱抑制剂伏立诺他（SAHA）为阳性对照，采用CCK-8法检测不同浓度的化合物对肿瘤细胞增殖的抑制作用；选择HDAC1、HDAC6抑制剂筛选试剂盒，对CCK-8初筛显示体外抗肿瘤活性好的化合物进行酶抑制活性评价；流式细胞术检测高成药性的化合物对肿瘤细胞周期和凋亡的影响。 结果： 1.根据Cap修饰策略，第一种方案：引入了在很多激酶抑制剂如EGFR抑制剂中经常出现的4-苯胺基喹唑啉片段，设计合成了17个化合物9a-q；第二种方案：为了比较Cap基团的化学空间构象对抑制活性的影响，设计合成了苯基并环结构作为Cap的化合物12a-c。 2.CCK-8法结果显示，两种方案设计出的系列化合物中有15种化合物体外显示出不同程度的抗肿瘤活性，其中9m、9n、9o、9q、12c化合物对人黑色素瘤细胞A375、人非小细胞肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7、人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、人结肠癌细胞HCT-116和人胃腺癌细胞SGC-7901具有广谱的抗增殖活性。其中A375和MCF-7细胞对化合物最敏感，大多数第一类化合物对A375细胞的抑制活性优于TBSA；选择化合物9m、9q和12c作为代表性化合物，进一步评估它们对HDAC1和HDAC6的抑制活性。 3.HDAC酶选择性抑制实验结果显示，9m、9q和12c化合物对HDAC6的抑制活性显著高于对HDAC1；化合物12c对HDAC1和HDAC6均有明显抑制，提示可能会有广谱HDAC酶抑制活性；化合物9m、9q对HDAC1的抑制活性较差。 4.流式细胞术检测细胞周期结果显示，A375细胞用化合物9m、9q、12c处理后，处于G2期的细胞数量增多，G1和S期的细胞数量减少。细胞凋亡结果显示，给药组可以明显增加A375细胞的凋亡率。 结论： 1.以4-苯胺基喹唑啉为Cap的化合物和以苯基并环结构为Cap的化合物对A375、MCF-7等细胞系均具有广谱的抗增殖活性，不同细胞对筛选化合物的敏感程度不同，其中苯基并环结构为Cap的化合物12c和4-苯胺基喹唑啉为Cap的化合物9m、9q具有良好的体外抗肿瘤活性。 2.以苯基并环结构为Cap化合物可能为具有广谱HDAC抑制活性，代表化合物12c，以4-苯胺基喹唑啉为Cap的化合物具有HDAC选择性抑制活性，代表化合物9m、9q。 3.化合物9m、9q、12c可以促进A375细胞的凋亡，影响细胞周期。 第二部分计算模拟方法探索化合物9q和12c在HDAC1和HDAC6中的作用机制 目的：考虑到两类化合物的化学骨架差异主要在于Cap基团，研究选取以4-苯胺基喹唑啉为Cap基团的代表化合物9q，以苯基并环结构为Cap基团的代表化合物12c，本部分主要通过分子对接、分子动力学模拟等计算模拟方法探究Cap基团的改变如何影响它们在HDAC1和HDAC6中的结合机制。 方法：采用CDOCKER程序进行分子对接实验构建化合物9q和12c在HDAC1和HDAC6中的对接初始构象，用AMBER20软件进一步对初始构象进行了150ns分子动力学模拟，以最后动态平衡的30ns模拟轨迹（120-150ns）用于分解自由能分析，确定有利于配体结合的关键残基，并在整个模拟过程中监测异羟肟酸上的羰基、羟基氧原子与锌离子之间的鳌合距离（distance1，d1；distance2，d2），以探讨这两个化合物与锌离子的螯合作用。 结果： 1.构建了化合物9q和12c在HDAC1和HDAC6中的对接构象，发现Cap基团在催化口袋入口处的朝向存在一定的差异，Linker和ZBG可以占据疏水口袋，且锌离子鳌合基团(ZBG)和锌离子之间的空间距离比较接近，保证了它们的螯合作用。 2.在MD模拟过程中，通过均方根偏差(RMSD)监控，发现受体和结合位点上的氨基酸波动相对较小，很快达到平衡状态；除了HDAC1—12c研究体系外，HDAC6—12c研究体系以及HDAC1—9q研究体系、HDAC6—9q研究体系中配体具有一定的波动性，但也可以随着MD模拟时间的延长达到动态平衡。在HDAC6研究体系中，化合物9q、12c与ASP170和ASP263两种氨基酸残基相互作用，具有一定的靶点亲和力，从而影响酶的催化活性，在HDAC1系统中化合物12c的ZBG基团可延伸到活性口袋的底部，与ASP169、HIS171和ASP257这三种氨基酸残基有较强的相互作用，而化合物9q的ZBG基团不能延伸到活性口袋的底部。 3.随着分子动力学模拟进行，HDAC1—9q研究体系中，d1从2.1?增加到4.3?，d2从4.1?增加到6.4?，而在其他研究体系中，d1维持在2.1和2.2?之间，d2维持在4.4和4.6?之间。 结论： 1．化合物12c的Linker部分可深入HDAC1和HDAC6活性口袋，从而使ZBG达到活性口袋底部的Zn2+催化区域，并与维持锌离子的稳定性的氨基酸残基相互作用，从而在两种HDAC亚型之间表现出广谱抑制活性。 2．不同于HDAC6，HDAC1活性口袋较深而窄，很难容纳4-苯胺基喹唑啉片段，在分子动力学模拟过程中，9q的Linker向活性口袋外移动，进而使ZBG远离Zn2+催化区域，削弱了与金属Zn2+的鳌合能力，使化合物9q对HDAC1抑制活性降低，从而在HDAC1和HDAC6之间表现出选择性抑制活性。
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