摘要
研究背景 蒽环类药物在临床上广泛应用的一种抗癌谱广、抗癌效果强的化疗药物。但是，蒽环类药物会导致不可逆的心脏损害，其剂量依赖性心肌损伤作用限制了临床应用。右丙亚胺是唯一被美国食品药品监督管理局（FoodandDrugAdministration,FDA）认可的用于治疗蒽环类药物引起的心脏损害的药物，但由于其价格昂贵、获取困难，在临床的应用并不广泛。目前，蒽环类药物心肌毒性的治疗仍旧面临着缺乏靶向性以及个体化治疗方案的局面。蒽环类药物导致心肌毒性的机制尚未完全阐明，以往认为主要包括氧化应激、线粒体损伤、钙超载以及铁代谢失衡等。因此，深入研究蒽环类药物的心肌损伤机制并找到有效的干预靶点，是当前肿瘤心脏病学领域的一项重要任务。 铁死亡是一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的细胞死亡形式，在2012年被确定为一种独特的现象并命名。铁死亡涉及广泛的生物学背景，铁死亡与发育、衰老、免疫、癌症和器官损伤等多种疾病密切相关。最新研究表明铁死亡参与蒽环类药物所致的心肌损伤并在蒽环类药物心肌损伤中起主导作用。因此深入研究在蒽环类药所致心肌损伤中调控铁死亡的分子和通路对阐明蒽环类药物心肌损伤的发病机制至关重要。 第一部分ATP6V0A2在表柔比星所致心肌损伤中的作用 研究目的 基因芯片测序筛选出在表柔比星（Epirubicin,EPI）心肌损伤中的差异表达基因。通过体外及体内实验验证差异表达分子液泡型ATP酶亚基a2（ATP6V0A2）在EPI诱导的心肌细胞损伤中的表达情况并评估ATP6V0A2在EPI心肌损伤中的生物学功能。 研究方法 1.新生乳小鼠心室心肌细胞（neonatalmiceventricularcardiomyocytes，NMVMs）的提取及鉴定。EPI干预NMVMs，建立蒽环类药物心肌损伤模型。利用基因芯片技术检测该模型的mRNA表达谱，通过生物信息学方法分析筛选出差异表达基因。 2.培养小鼠HL-1心肌细胞系，建立EPI心肌细胞损伤模型，采用qRT-PCR和WesternBlot验证ATP6V0A2在EPI心肌损伤中的表达。心肌细胞过表达ATP6V0A2后用EPI干预，评估心肌细胞的损伤情况：相差显微镜观察细胞形态；CCK-8检测细胞增殖活力；LDH释放实验检测心肌细胞损伤程度；WesternBlot检测心肌损伤标志物ANP。 3.采用腺相关病毒（Adeno-AssociatedVirus，AAV）病毒载构建心脏特异性过表达ATP6V0A2的小鼠，EPI尾静脉注射建立小鼠蒽环类药物心肌损伤模型。WesternBlot检测小鼠心脏ATP6V0A2的表达情况；多普勒超声检测小鼠心脏功能指标左心室射血分数（EjectionFractions，EF）和左心室缩短分数（FractionalShortening，FS）；小鼠心脏组织HE染色和Masson染色观察小鼠心脏结构变化；WesternBlot检测心肌损伤标志物心房钠尿肽（AtrialNatriureticPeptide，ANP）的表达。 研究结果 1.基因芯片测序表明在NMVMs的EPI心肌损伤模型中有5621个基因上调，5118个基因下调。在EPI心肌损伤的HL-1心肌细胞模型中，ATP6V0A2在mRNA水平和蛋白水平均显著下调，与芯片测序结果一致。 2.心肌细胞过表达ATPV60A2后，EPI干预后的心肌细胞死亡数量明显减少，细胞增殖活性明显增高，培养上清中LDH释放明显减少，心肌损伤标志物ANP的表达明显下降。 3.在EPI给药后，小鼠心功能指标EF、FS下降，心肌组织纤维化加重，心肌损伤标志物ANP表达增加。而小鼠心脏特异性过表达ATP6V0A2后，心脏左室EF、FS显著升高，心肌组织纤维化显著下降，心肌损伤标志物ANP表达显著减少。 研究结论 EPI下调心肌细胞中ATP6V0A2的表达。过表达ATP6V0A2可显著抑制EPI心肌损伤并保护小鼠的心脏功能。 第二部分表柔比星通过ATP6V0A2激活心肌细胞铁死亡导致心肌损伤 研究目的 探究铁死亡在EPI心肌损伤中的作用。阐明ATP6V0A2在表柔比星诱导的心肌细胞铁死亡中的作用。 研究方法 1.采用Erastin诱导心肌细胞发生铁死亡，根据EPI干预心肌细胞时是否有铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）共处理。将细胞分组为DMSO组，Erastin组，EPI组，EPI+Fer-1组。药物干预后，评估心肌细胞的损伤情况：相差显微镜观察细胞形态；CCK-8检测细胞增殖活性；LDH释放实验检测心肌细胞损伤程度；WesternBlot检测心肌损伤标志物ANP在蛋白水平的表达。评估心肌细胞在药物干预后是否发生铁死亡：qRT-PCR和WesternBlot检测心肌细胞中铁死亡相关分子前列腺素-内过氧化物合酶2（Prostaglandin-EndoperoxideSynthase2，PTGS2）、NADPH过氧化物酶1（NADPHOxidase1，NOX1）在mRNA水平和蛋白水平的表达；DCFH-DA探针检测心肌细胞活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS）的水平；脂质过氧化探针BODIPY-C11581-591检测心肌细胞脂质活性氧（Lipid-Reactiveoxygenspecies,lipid-ROS）的水平；检测心肌细胞谷胱甘肽（Glutathione，GSH）含量。 2.ATP6V0A2质粒转染心肌细胞构建过表达ATP6V0A2的心肌细胞模型，DMSO或EPI干预。将细胞分组为Scramble+DMSO组，ATP6V0A2OE+DMSO组，Scramble+EPI组，ATP6V0A2OE+EPI组。评估ATP6V0A2在EPI诱导的心肌细胞铁死亡中的作用：qRT-PCR和WesternBlot检测心肌细胞中铁死亡相关分子PTGS2、NOX1在mRNA水平和蛋白水平的表达；DCFH-DA探针检测心肌ROS水平；BODIPY-C11581-591探针检测心肌细胞lipid-ROS水平；检测心肌细胞GSH含量。 3.透射电镜观察对照组小鼠和心脏过表达ATP6V0A2的小鼠在EPI给药后心肌细胞的线粒体形态。 研究结果 1.Erastin处理心肌细胞后，观察到细胞萎缩，体积变小；EPI处理后，心肌细胞大量死亡，而Fer-1与EPI共处理后，心肌细胞死亡率显著下降。Erastin与EPI干预后，心肌细胞增殖活力降低、LDH释放增加以及心肌损伤标志物ANP表达升高；而Fer-1与EPI共处理后，细胞增殖活力显著升高、LDH释放减少，且心肌损伤标志物ANP表达降低。Erastin或EPI干预后PTGS2、NOX1表达增加，心肌细胞ROS和lipid-ROS水平明显升高，GSH水平明显降低；Fer-1与EPI共处理后，PTGS2、NOX1表达显著降低，ROS和lipid-ROS水平显著降低，GSH水平显著升高。 2.EPI干预后，与对照组相比，过表达ATP6V0A2的心肌细胞中：PTGS2和NOX1表达显著降低，ROS和lipid-ROS水平显著降低，GSH水平显著升高。 3.EPI给药后，透射电镜观察到小鼠心肌细胞的线粒体缩小，膜密度压缩，嵴减少，外膜破裂更为明显；在心脏过表达ATP6V0A2的小鼠心肌细胞的线粒体形态异常明显减少。 研究结论 铁死亡参与EPI损伤心肌细胞的病理生理过程，EPI通过下调ATP6V0A2激活心肌细胞铁死亡导致心肌损伤。 第三部分表柔比星下调ATP6V0A2激活铁死亡致心肌损伤的机制研究 研究目的 阐释ATP6V0A2在EPI心肌损伤中调控铁死亡的分子机制。 研究方法. 1.WesternBlot检测心肌细胞及小鼠心肌组织中溶酶体功能相关分子溶酶体膜相关蛋白2（LysosomalAssociatedMembraneProtein2，LAMP2）和组织蛋白酶B（CathepsinB）的表达。 2.用液泡型ATP酶（VacuolarATPase，V-ATPase）抑制剂巴弗洛霉素A1（BafilomycinA1，BafA1）与EPI共处理心肌细细胞。LysosensorDND-189检测溶酶体的酸度；CCK-8实验检测心肌细胞的增殖活力。 研究结果 1.EPI处理后，心肌细胞和小鼠心肌组织中LAMP2和CathepsinB表达明显增加；过表达ATP6V0A2后，LAMP2和CathepsinB表达显著降低。 2.EPI干预心肌细胞后，溶酶体酸度明显下降；心肌细胞过表达ATP6V0A2后，溶酶体酸度显著升高。BafA1与EPI共处理后，心肌细胞过表达ATP6V0A2不能维持溶酶体酸度，也不能提高心肌细胞活力。 研究结论 ATP6V0A2通过促进溶酶体酸化功能抑制心肌细胞铁死亡，从而改善表柔比星所致的心肌损伤作用。
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