摘要
前列腺癌（PCa）是一种雄激素依赖性肿瘤，雄激素可以刺激前列腺癌细胞的生长进而加快疾病的进展。雄激素剥脱治疗（ADT）是中晚期前列腺癌的一线治疗。然而，大多数患者在接受ADT治疗后最终仍会发展成为转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）。 恩杂鲁胺（Enzalutamide，Enz）是一种新的高亲和力抗雄激素药物，他通过直接与雄激素受体（AR）结合并抑制配体-受体复合物的核易位和共激活剂募集来阻断雄激素信号转导。在目前的临床研究中，恩杂鲁胺已被证明可以阻断AR和DNA的结合，导致细胞凋亡和肿瘤生长迟缓，进而延长CRPC的生存率。但最近的一些研究表明，Enz能够促进CRPC的侵袭，具体机制仍然不清楚。在此研究中，我们发现Enz会通过增加NR2F1的表达进而抑制雄激素受体（AR），然后诱导转移基因MMP2过表达，最后促进CRPC的转移。这意味着，NR2F1可能是前列腺癌细胞转移的关键因素。因此，抑制NR2F1的表达可能是治疗CRPC转移的新方法。 第一部分恩杂鲁胺通过增强癌基因NR2F1表达来促进CRPC细胞侵袭 目的：探讨恩杂鲁胺对CRPC细胞的影响。 方法：我们用RNAseq方法找到癌基因NR2F1，因为最新的研究表明NR2F1可能在人类肿瘤发展中起到关键作用，NR2F1的较高表达可能会导致肿瘤的复发和转移。此外，仍有研究显示NR2F1在前列腺癌细胞中的表达高于临近的良性组织，并且NR2F1表达的下调与前列腺癌细胞的侵袭力降低呈正相关。更有趣的是，我们的临床数据表明，在一些接受ADT治疗的人类前列腺癌样本中，NR2F1的表达也是高于癌旁组织的。我们首先证实了在经过恩杂鲁胺处理48小时的CRPCC4-2细胞中RNAseq的发现。结果表明，添加恩杂鲁胺可以降低雄激素受体（AR）的活性（通过则定AR靶基因PSA的表达），而显著增加NR2F1的表达。我们进一步证实了NR2F1对CRPC细胞侵袭的影响。Transwell试验（细胞侵袭实验）结果显示，与对照组（加DMSO）相比，加入恩杂鲁胺48小时后，C4-2细胞的侵袭能力增强，而敲除NR2F1后则显著降低了恩杂鲁胺诱导的C4-2细胞的侵袭能力。当我们用前列腺CWR22rv1癌细胞取代C4-2细胞时，也得到了相似的结果。 结论：恩杂鲁胺通过增强癌基因NR2F1的表达促进CRPC细胞的侵袭。 第二部分研究恩杂鲁胺增强癌基因NR2F1表达的机制 目的：明确恩杂鲁胺促进癌基因NR2F1高表达的分子机制。 方法：首先，敲除AR后测定NR2F1mRNA和蛋白质表达。同时作为对照，我们还发现降低AR的表达可能会导致PSAmRNA水平的降低。相反，增强AR的表达可以降低C4-2细胞NR2F1mRNA和蛋白的表达，同时增加PSAmRNA的水平。当我们用CWR22Rv1细胞代替CRPCC4-2细胞时，获得了同样的结果。然后，我们用jasper数据库搜索潜在的NR2F15启动子区域的雄激素反应元件（AREs），发现转录起始位置上游2kb碱基内的潜在ARE。我们在C4-2细胞中进行了染色质免疫沉淀(CHIP)测定，发现AR能够与位于启动子的-1082至-1068nt上的ARE结合。我们又将荧光素酶实验应用于C4-2细胞，结果显示AR可以抑制C4-2细胞中荧光素酶报告活性。最重要的是，我们将-1082至-1068nt的关键序列突变后，荧光素酶报告活性没有显著差异。 结论：AR可以通过直接与C4-2细胞中NR2F1启动子上的ARE结合，在转录水平上调节NR2F1的表达。 第三部分恩杂鲁胺通过AR-NR2F1-MMP2通路增强CRPC细胞侵袭 目的：明确恩杂鲁胺是通过AR-NR2F1-MMP2通路促进前列腺癌细胞侵袭。 方法：MMP家族成员与多种癌症的进展和转移密切相关，主要作用之一是它们在细胞外基质（ECM）降解中的作用，ECM降解后癌细胞从原发肿瘤中迁移出来而形成转移。我们通过检测这些基因的mRNA水平是否收到AR和NR2F1的调控筛选出MTMMP1、MMP1、MMP2、MMP9、MMP13等基因。在敲除AR后，C4-2细胞中MTMMP1、MMP1、MMP2、MMP9的mRNA水平升高，而NR2F1仅能逆转C4-2细胞中MMP2的增加。此外，我们在TCGA数据库中发现，人前列腺癌组织中MMP2水平与NR2F1水平呈正相关。WB实验证实了AR是通过NR2F1调节MMP2且AR下调NR2F1和MMP2的蛋白表达，NR2F1的下调导致C4-2细胞通过下调AR导致的MMP2高表达失败。我们用恩杂鲁胺降低AR活性后得到了相似的结果。我们继续用CWR22Rv1细胞取代C4-2细胞，结果相同。最后，WB实验结果显示，AR过表达抑制了NR2F1和MMP2的蛋白表达，且NR2F1过表达导致C4-2细胞因AR过表达而导致MMP2的低表达失败。用CWR22Rv1细胞取代C4-2细胞，结果相同。结论：NR2F1介导AR调节MMP2的表达进而促进肿瘤细胞侵袭。
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