摘要
番茄灰霉病是由灰葡萄孢引起的真菌性病害，具有侵染植物根、茎、叶的能力，番茄灰霉病的发生会导致番茄减产，进而造成巨大的经济损失。目前，防治番茄灰霉病的主要方式为施用化学农药，但长期施用化学农药会导致环境污染、农药的残留及抗药性等问题。生物防治是对环境友好、符合绿色农药发展的防治植物病害的方法，也是防治番茄灰霉病的一种重要手段。本研究从番茄根际土壤中分离筛选出高效防治番茄灰霉病菌的生防菌株D25，并对菌株D25及其发酵液的生防效果进行测定。同时，测定菌株D25对番茄植株促生作用及其对土壤微生物群落结构的影响。进一步，对菌株D25的全基因组及转录组进行测定，对生防关键基因suhB进行敲除，确定基因suhB对生防菌株防治番茄灰霉病菌的影响。 主要研究内容如下： （1）番茄灰霉病菌生防菌的分离筛选及鉴定。从番茄根际土壤中分离筛选出56株形态不同的细菌，7株对番茄灰霉病菌有较好的抑菌效果。其中，抑制效果最高的菌株为D25，通过生理生化鉴定及16SrDNA鉴定，确定该菌株为PantoeajilinensisD25。体外实验表明，菌株D25可有效的抑制番茄灰霉病菌的生长、孢子的产生，改变菌丝形态。离体叶片实验和盆栽实验结果表明，菌株D25可有效防治番茄灰霉病的发生。 （2）PantoeajilinensisD25发酵液对番茄灰霉病菌的抑制作用。当发酵时间为7d，发酵液抑菌活性最高。当发酵液的处理温度高于60℃、长期暴露于紫外线下及过酸过碱，会导致其抑菌活性降低。当发酵液的添加量为10%（v/v）时，发酵液可有效的抑制番茄灰霉病菌的生长、孢子的产生及菌丝干重。发酵液也可有效改变番茄灰霉病菌细胞膜通透性、提高其体内MDA的含量。通过离体叶片实验及盆栽实验，发现发酵液也可有效的防治番茄灰霉病的发生。进一步，对发酵液的主要抑菌活性物质进行测定，发现其主要的抑菌活性物质为1,2-苯二甲酸双（2-甲基丙基）酯（14.3098%）、2,4-二丁基苯酚（3.8036%）、2,6,10,14-四甲基十五烷（2.9947%）和1,3-二甲基萘（1.8586）。 （3）PantoeajilinensisD25促生耐盐活性的研究。土壤盐度是全球粮食安全面临的重大挑战，是一个重要的非生物胁迫因素，严重影响作物生长和产量。与NaCl处理组相比，菌株D25在盐胁迫下显著提高了番茄的鲜重、株高、根长和叶绿素含量，分别提高了46.7%、20%、42.4%和44.2%。菌株D25可增加番茄对各种大量元素和微量元素的吸收，减少了Na+的积累。在盐渍化土壤中施用菌株D25，可增加防御酶（SOD、PAL、PPO、POD、CAT）的活性，而丙二醛的含量降低。qRT-PCR实验结果表明，与离子转运蛋白、抗氧化机制、关键防御、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶合成和赤霉素（GA）信号蛋白相关基因（SlSOS1、SlNHX1、SlHKT1.1、SlSOD1、SlAPX2、SlAOS、SlPinⅡ、Solyc08g066270.1、Solyc03g083420.2和SlGA20ox1）的表达上调，且在NaCl+D25的处理组中最高。施用菌株D25后，与土壤肥力相关的酶（脱氢酶、脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶）的活性增强。土壤微生物测序结果表明，土壤微生物多样性和益生菌（如Acidibacter、Limnobacter和Romboutsia）的丰度显著增加。 （4）PantoeajilinensisD25全基因组测定及基因差异表达分析。通过全基因组测序，菌株D25基因组中包含染色体及2个质粒。环状染色体基因组总长度为4019203bp，GC含量为54.77%，而质粒1的基因组长度为131248bp，GC含有率为51.66%，质粒2的基因组长度483571bp，GC含量为52.56%。基于GO数据库，菌株D25的基因组中总共注释了13467个基因。共有6857个基因被注释到GO数据库的生物过程类别中，2848个基因被注释到细胞成分类别中，3762个基因被注释到分子功能类别中。基于COG数据库，在菌株D25的基因组中，共有4097个基因被预测为COG数据库的23个类别。在这些基因中，在氨基酸运输和代谢方面注释的基因最多（417个；3.1%），其次是碳水化合物运输和代谢（403个；3.0%）和一般功能预测（359个；2.7%）。基于KEGG数据库，菌株D25基因共有2806个基因富集在34个代谢途径中。氨基酸代谢途径中富集的基因最多（348个），其次是碳水化合物代谢途径（339个）。 通过差异表达分析，共有941个基因上调，997个基因下调。在GO数据库中，差异基因主要富集在生物学过程、细胞成分和分子功能。差异表达基因在生物学过程中的主要表达是有机氮化合物生物合成过程、翻译、肽代谢过程、肽生物合成过程、运动等。在细胞组成过程中，差异表达基因主要富集在细胞器、蛋白质复合体、核糖体、细胞质部分和细胞内部分。在分子功能上，差异表达基因主要富集在结构分子活性、核糖体结构成分、辅因子结合等方面。在生物体中，不同的基因相互协调以行使其生物功能。代谢途径的显著富集可以决定差异表达基因所涉及的主要生化代谢和信号转导途径。KEGG途径分析表明，差异基因主要富集在核糖体、鞭毛组装、细菌趋化性、同源重组、丙酸代谢。 （5）PantoeajilinensisD25生防相关基因的敲除。为确定菌株D25生物防治的机制，对基因suhB进行敲除。实验结果表明，ΔPj-suhB的游动能力和定殖能力均低于菌株D25。此外，我们发现ΔPj-suhB可抑制番茄灰霉病菌的菌落直径、菌丝重量和孢子产生，抑制率分别为31.72%、39.62%和47.42%，而菌株D25的抑制率为52.91%、60.09%和76.85%。ΔPj-suhB可下调番茄灰霉病中病程相关基因的表达量，但效果较菌株D25低。离体叶片实验结果表明，ΔPj-suhB和菌株D25对番茄灰霉病菌的生长具有抑制作用，其病变面积和防治效果分别为1.520和0.038cm2、68.7%和99.0%。盆栽实验结果表明，ΔPj-suhB可以预防番茄灰霉病菌的发生，疾病减少率为37.5%，而菌株D25疾病减少率为75.0%。此外，ΔPj-suhB可以提高防御相关酶活性、上调番茄植株中防御基因的表达量，但菌株D25对防御相关酶活性和基因表达量的影响较ΔPj-suhB大。
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