摘要
背景：细胞衰老是指与细胞形态学和代谢变化、基因表达改变等一系列特定表型变化相关的细胞周期停滞。表观遗传学变化亦是衰老的特征之一，在衰老的组织细胞样本中可以观察到表观遗传修饰的紊乱。mRNA的N6-甲基腺苷（m6A）修饰是控制包括细胞增殖、衰老、凋亡在内的基本生物学过程的主要化学修饰。通过甲基转移酶、结合蛋白和去甲基化酶的协调作用来调节mRNA的剪接、运输、稳定性和翻译过程。光老化是慢性紫外线引起的包括氧化应激在内的皮肤损伤与内源性老化的叠加。紫外线导致的真皮结缔组织成分的改变，最终将造成皮肤的外观和功能的变化。目前，有诸多机制参与了皮肤光老化的发生过程，但mRNA的m6A修饰在其中的调控作用鲜有报道。 目的：本研究旨在分析UVB诱导的人真皮成纤维细胞提前衰老（UVB-SIPS）模型中m6A的修饰模式，通过高通量测序筛选下游的靶基因；同时探索山楂酸对UVB诱导的皮肤氧化损伤的保护作用，以及对皮肤光损伤和光老化中m6A修饰的影响，为揭示皮肤光老化的发生机制以及探索新的延缓衰老措施提供思路。 方法： 1.使用多种UVB剂量对人真皮成纤维细胞（HFF-1）进行照射，选择适于构建UVB-SIPS模型的剂量，并对对照组和UVB-SIPS组细胞周期阻滞情况及p16、p21、p53、γ-H2AX的表达进行检测，验证模型的可靠性。用比色法和Dotblot检测对照组和UVB-SIPS组总RNA中m6A的含量。 2.在构建的UVB-SIPS模型中，通过qRT-PCR和Westernblot检测有无甲基化相关酶表达的改变。用慢病毒转染的方式构建差异表达的甲基化相关酶的过表达细胞，并验证该甲基化相关酶过表达后，HFF-1细胞m6A水平以及衰老表型的变化。 3.采用MeRIP-seq分析筛选空载组和甲基化相关酶过表达组HFF-1细胞中m6A修饰差异的基因，结合qRT-PCR和Westernblot验证对照组和UVB-SIPS组中该基因的表达情况。 4.检测不同UVB照射剂量和不同山楂酸浓度对HFF-1细胞增殖活性的影响，选择适合的UVB剂量构建UVB诱导的HFF-1细胞损伤模型。检测不同的山楂酸给药时机下ROS的清除情况，以此选择合适的给药时间和浓度。检测山楂酸给药对SOD、CAT活性，及IL-6、TNF-α、MMP3产生的影响。通过Westernblot，探索山楂酸在IκBα降解和NF-κB核易位中的作用。检测UVB诱导的HFF-1细胞损伤模型中m6A修饰和甲基化酶的变化。 结果: 1.选择总剂量75mJ/cm2，即单次照射剂量15mJ/cm2连续照射HFF-1细胞5天作为后续实验的模型构建方式。在UVB-SIPS模型中观察到了细胞增殖活性的降低，SA-β-gal阳性细胞显著升高，G1期细胞比例较NC组增加，p53、p21、p16和γ-H2AX的表达上调。总RNA的m6A含量在UVB-SIPS模型中增加。 2.HFF-1的UVB-SIPS模型中METTL3、FTO的蛋白水平较NC组下降，METTL14的表达增加，而ALKBH5未见明显改变。用慢病毒转染构建了过表达FTO的稳定转染细胞株。过表达FTO后，总RNA的m6A水平下降。对FTO空载和FTO过表达细胞均进行了UVB连续多次照射，FTO过表达细胞的增殖活性、SA-β-gal阳性染色率和G1期阻滞较空载组照射UVB的细胞均改善，p16、p21、p53的表达较空载组照射细胞下调。 3.对FTO空载和FTO过表达细胞进行MeRIP-seq，共检测到了1720个m6A修饰差异peak，其中1000个修饰上调，720个修饰下调。对差异peak相关基因的GO和KEGG分析表明m6A差异修饰的转录本与细胞外基质组织密切相关。在富集到该生物过程的基因中，发现SERPINH1的mRNA水平在NC和UVB-SIPS组中无明显差异，但蛋白水平在UVB-SIPS组中下降，可能是FTO-m6A调控的靶基因。 4.CCK8对细胞增殖活性的检测结果显示50mJ/cm2的UVB单次照射可以在不引起细胞大量死亡的情况下产生损伤；10μmol和20μmol山楂酸对细胞增殖活性的提高最为显著。UVB照射前24小时加入山楂酸与照射后立即加入山楂酸共培养24小时相比，前者对细胞增殖活性的改善更显著，也更能使ROS水平下降。但10μmol和20μmol组间无明显差别。加入10μmol的山楂酸共培养24小时后照射UVB，较未给予山楂酸的UVB照射组SOD、CAT水平升高，IL-6的分泌减少，IL-6、TNF-α、MMP3的mRNA水平下降。照射前24h加入山楂酸抑制了NF-κB的核易位与IκB的降解，且可以降低UVB照射引起的m6A水平增加。 结论：本研究发现，在UVB诱导的真皮成纤维细胞衰老过程中，m6A修饰水平增加，伴随着FTO水平下降，过表达FTO可以改善真皮成纤维细胞的衰老表型。SERPINH1可能是皮肤光老化中FTO介导的m6A修饰改变的潜在靶点。山楂酸可能通过抑制NF-κB的核易位对UVB造成的人真皮成纤维细胞氧化损伤发挥保护作用，同时山楂酸可以降低UVB引起的m6A增加，有良好的应用前景。
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