摘要
多环芳烃类(PolycyclicAromaticHydrocarbon,PAHs)主要来源于能源和其他有机物的不完全燃烧或热降解,在空气中冷却后大部分吸附在细颗粒物(粒径≤2.5μm)上,可通过呼吸、饮食、皮肤接触等多种途径进入人体内.当人群暴露在含高浓度PAHs的室内空气中时,血清中PAHs原型明显升高,说明通过呼吸道进入人体是PAHs的一条重要的暴露途径.以往,PAHs的危害主要存在煤炭、石油、煤焦油开采等工厂中,所以,关于PAHs对人体健康影响的研究多集中在特殊环境或者职业暴露下的影响.近年来,因煤炭消耗量不断增加和机动车尾气排放等因素使得大气PAHs污染日益严峻.PAHs对健康的影响已经从职业暴露人群扩展到普通人群中.已有的流行病学研究表明,多环芳烃可能对儿童哮喘产生不良影响.然而,其潜在的分子机制仍有待完全阐明.本研究旨在从代谢途径,尤其是一碳代谢和色氨酸代谢途径阐明PAHs诱发儿童哮喘的机制. 研究目的:本研究旨在基于代谢组学,即一碳代谢和色氨酸代谢途径阐明PAHs暴露对儿童哮喘的影响. 研究方法: 1.评估哮喘患儿PAHs内暴露水平与炎症状态 经伦理审查和知情同意,本课题于南京医科大学附属儿童医院和江苏省中医院收集哮喘儿童与对照儿童的血液样本(50∶50),首先使用酶联免疫吸附测定(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)检测血清中的总免疫球蛋白E(ImmunoglobulinE,IgE)评估儿童炎症水平.采用GC-MS/MS(GasChromatographMassSpectrometer/MassSpectrometer)检测其血清中PAHs原型以评估其内暴露水平,使用Logistic回归评价PAHs暴露对儿童哮喘的影响. 2.靶向分析哮喘患儿一碳代谢水平,阐明PAHs通过一碳代谢影响DNA/组蛋白甲基化模式,并调节IL-17A表达的机制 本课题通过超高效液相色谱-质谱联用技术(Ultra-PerformanceLiquidChromatograph-MassSpectrometry,UPLC-MS)检测人群血清中一碳代谢物水平.并进一步通过亚硫酸氢盐测序(BisulfiteSequencingPCR,BSP)检测两组人群外周血白细胞中的LINE-1甲基化模式;采用染色质免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitationassay,ChIP)分析结合在IL-17A启动子区H3K4me3富集情况.ELISA检测血清中IL-17A的表达水平.中介分析一碳代谢物及表观遗传在PAHs诱发儿童哮喘过程中的中介效应. 3.靶向分析色氨酸相关代谢物水平,阐明PAHs通过色氨酸-AHR-炎症因子轴调控炎症. 通过UPLC-MS检测人群血清中的色氨酸代谢物水平.采用Pearson相关分析PAHs与色氨酸相关代谢物之间的相关关系.中介分析色氨酸代谢物在PAHs诱发儿童哮喘过程中的中介效应. 4.构建PAHs暴露小鼠模型,从代谢角度阐明PAHs影响肺部炎症的机制 根据南京市大气中PAHs的比例与浓度,构建PAHs暴露动物模型.采用ELISA检测小鼠支气管肺泡灌洗液(BronchoalveolarLavageFluid,BALF)和血清中的炎症因子;用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-Eosinstaining,HE染色)观察PAHs暴露小鼠肺组织中淋巴细胞浸润,评价PAHs暴露对小鼠肺部炎症的影响. 采用代谢组学分析PAHs对小鼠代谢轮廓的影响,并富集分析差异代谢物的代谢通路.采用靶向代谢检测PAHs暴露小鼠一碳代谢模式的变化.进一步通过甲基化修饰依赖性内切酶测序法(Methylation-dependentRestriction-siteAssociationDNAsequencing,Methyl-RAD)和ChIP检测PAHs对小鼠肺组织的全基因组甲基化与结合在Il-17a启动子区的组蛋白甲基化模式的影响,并通过蛋白质免疫印迹法(WesternBlot,WB)检测组蛋白H3K4me3的表达.ELISA检测小鼠血清和肺泡灌洗液中IL-17A的表达水平. 对小鼠粪便进行16SrRNA测序,分析其肠道菌群特征的改变.采用代谢组学与靶向代谢相结合的方式分析PAHs对小鼠色氨酸代谢的影响.采用实时荧光定量PCR(quantitativeReal-timePCR,qPCR)检测AHR及其下游基因的表达. 研究结果: 1.PAHs内暴露水平与儿童哮喘相关 与对照组相比哮喘患儿血清中总IgE浓度显著升高.血清中PAHs的比例在哮喘组和对照组中的分布一致,由高到低依次为芘(Pyrene,Pyr)＞菲(Phenanthrene,Phe)＞芴(Fluorene,Flu)＞荧蒽(Fluoranthene,Fla)＞屈(Chrysene,Chr)＞苯并(a)蒽(Benzo(a)anthracene,BaA),血清Pyr所占比例最高.Mann-whitneyU检验显示,哮喘患儿血清中Flu、Fla、Pyr、Chr和BaA等PAHs高于对照组.Logistic结果显示,Fla、Pyr、BaA和INP/DBA与儿童哮喘相关,差异具有统计学意义. 2.PAHs通过一碳代谢影响DNA/组蛋白甲基化模式并调节IL-17A表达 哮喘儿童的一碳代谢物含量与对照组人群存在显著差异.与对照组相比,哮喘儿童血清中甲硫氨酸(Methionine,Met)和S-腺苷甲硫氨酸(S-AdenosylMethionine,SAM)显著下降,S-腺苷同型半胱氨酸(S-AdenosineHomocysteine,SAH)也相应的降低,并且SAM与SAH的比值也显著降低,这表明一碳代谢产生甲基的能力增强.对差异一碳代谢物与PAHs做Pearson相关性分析,其中Fla与SAM、SAH和5-甲基四氢叶酸(5-MethyltetrahydrofolicAcid,5-MT)等代谢物均呈负相关,且相关性强.中介分析显示SAH、SAM和丝氨酸(Serine,Ser)在Fla与儿童哮喘间起到中介效应.BSP显示哮喘儿童长散布核元件-1(Longinterspersednuclearelement-1,LINE-1)的甲基化水平升高,表明该人群全基因甲基化有上升趋势.中介分析显示LINE-1在Fla与儿童哮喘间起到中介效应.ChIP显示结合在IL-17A启动子区的组蛋白H3K4me3富集增加,中介分析显示H3K4me3在Fla与儿童哮喘间起到中介效应.此外,哮喘儿童血清中的IL-17A也明显高于对照组. 3.PAHs通过色氨酸-AHR-炎症因子轴调控炎症 哮喘儿童的色氨酸代谢模式与对照组存在差异.哮喘儿童的色氨酸(Tryptophan,Trp)、色胺(Tryptamine)、3-吲哚丙烯酸(IndoleAcrylicAcid,IA)、吲哚乙酸(IndoleAceticAcid,IAA)和吲哚(Indole)的浓度显著升高,吲哚-3-甲醛(Indole-3-Aldehyde,IAld)和吲哚-3-乙醛(Indole-3-Acetaldehyde,IAAld))的浓度相对较低.差异色氨酸代谢物主要富集在与菌群代谢相关的Indole通路上.Pearson相关分析显示Pyr与色氨酸相关代谢物吡啶甲酸(PicolinicAcid,PIC)、喹啉酸(QuinolinicAcid,QUI)、5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine,5-HT)、5-羟基吲哚乙酸(5-HydroxyindoleAceticAcid,5-HIAA)和Indole呈正相关,与IAld呈负相关,其中PIC和QUI为色氨酸代谢中的犬尿氨酸途径,5-HT和5-HIAA为血清素途径.Fla与IAld呈显著负相关,IAld是色氨酸代谢中Indole-AHR途径上的相关代谢物.中介分析提示,Trp相关代谢物对IL-17A的表达和儿童哮喘有直接效应,但是在PAHs浓度与儿童哮喘结局之间没有中介效应. 4.PAHs暴露引起小鼠肺部炎症 PAHs暴露小鼠BALF中总IgE水平明显升高.IL-4在PAHs暴露组中也显著升高.HE染色显示PAHs暴露小鼠肺组织中有淋巴细胞浸润. 5.PAHs通过一碳代谢-表观遗传-炎症因子轴影响小鼠肺部炎症 PAHs暴露小鼠血清中检测出48种代谢物与对照组存在显著差异,其中一碳代谢物5-MT、Ser、甘氨酸(Glycine,Gly)、Met、SAM和SAH等代谢物呈下降趋势,SAM与Met的比值升高,表明PAHs暴露提高了甲基化能力.与对照组相比,PAHs暴露组甲基转移酶Dnmt-1的表达明显上调.Methyl-RAD结果显示PAHs的暴露引起小鼠肺组织全基因组甲基化水平上升.ChIP分析显示,PAHs暴露组在Il-17a基因启动子区域结合的组蛋白H3K4me3富集增加,同时,WB结果显示,H3K4me3的表达升高. 6.PAHs通过肠道菌群-色氨酸代谢-AHR-炎症因子轴影响肺部炎症 PAHs的暴露引起色氨酸代谢通路中Tryptamine、IA、IAA、IAld和Indole等代谢物的相对丰度显著升高,这些代谢物均可作为配体激活AHR.Ahr在PAHs暴露小鼠的肺组织和结直肠组织中转录水平上调.其下游基因Cyp1a1也有相应程度的提高.Il-17a在PAHs暴露组结直肠组织中上调.在属水平上,PAHs暴露组的Muribaculaceae菌属,Lactobacillus菌属,Clostridia菌属,Faecalibaculum菌属,Lachnospiraceae菌属,Ruminococcus菌属,Alistipes菌属和Romboutsia菌属的丰度显著增加.在种水平上,PAHs暴露组中Lactobacillus_murinus、Akkermansia_muciniphila和Clostridia_UCG-014丰度升高.其中Lactobacillus、Akkermansia和Clostridia菌属均与色氨酸代谢相关. 研究结论: 1.PAHs通过调节一碳代谢谱,干扰表观遗传模式(DNA/组蛋白甲基化),影响炎症因子表达,引起炎症并诱发哮喘. 2.PAHs通过肠道菌群干扰色氨酸代谢,影响AHR及其下游基因的表达,从而引起炎症因子表达失调,诱发炎症.
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