摘要
实验目的：许多化疗药物可诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，导致损伤相关分子模式和肿瘤相关抗原的释放。这一过程促进了树突状细胞的成熟和细胞毒性T淋巴细胞的浸润。然而，癌细胞可以利用多种机制来逃避宿主免疫系统监测。最近的研究表明，干扰素基因刺激因子激动剂，如cGAMP，可以诱导I型干扰素和促炎因子释放以增强免疫细胞对肿瘤微环境的浸润。基于这些发现，我们构建了用于B16-F10黑色素瘤和4T1三阴性乳腺癌治疗的阿霉素和cGAMP共递送系统（DOX/cGAMP@NPs），对上述两种药物协同增强抗肿瘤免疫治疗的效果进行评价，为推进化疗-免疫联合治疗的应用提供实验和理论基础。 实验方法：首先，通过RAFT聚合反应合成聚合物载体材料，并通过薄膜水化法制备纳米粒。然后对纳米粒的理化性质进行了表征，考察了纳米粒的粒径、zeta电位、形貌特征、血清稳定性以及cGAMP与载体材料的最佳N/P比等指标，并采用荧光分光光度法和高效液相色谱法分别考察DOX和cGAMP的包封率和载药量。此外，还通过薄膜透析法，考察DOX/cGAMP@NPs中DOX和cGAMP的释放行为。 在体外细胞实验中，考察了4T1和B16-F10两种肿瘤细胞对两种药物的摄取行为，并采用MTT法研究使用不同制剂组处理细胞后的细胞活性。随后通过ELISA试剂盒、流式细胞术和激光共聚焦显微镜进一步评估了不同制剂对两种肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡诱导能力。将不同DOX制剂处理过的4T1和B16-F10细胞与体外未成熟的BMDCs共培养24h，通过流式细胞术分析体外BMDCs的成熟情况。 在体内实验中，首先考察了纳米载体在荷瘤小鼠体内的分布情况。随后研究了经小鼠尾静脉给药不同制剂后对肿瘤的生长抑制情况，并制作肿瘤切片，通过Hamp;E染色，CRT、TUNEL、Ki67抗体染色，观察组织病理情况。取三次治疗后的小鼠，收集并制备肿瘤细胞悬液、引流淋巴结悬液，用多抗体染色，通过流式细胞术评估调节性T细胞、骨髓来源的抑制性细胞、M2型巨噬细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞所占比例，考察纳米递送系统激活体内免疫反应、逆转肿瘤免疫微环境的能力。 实验结果：核磁氢谱分析证明聚合物材料合成成功。DOX和cGAMP被有效包封到该递药系统中，粒径分布在100-200nm间，室温下血清稳定性良好且具有明显的缓释作用。当N/P为15时，粒径不发生明显变化。因此选择N/P=15进行后续实验。 流式细胞术实验证明了该递药系统能被B16-F10细胞和4T1细胞有效摄取，激光共聚焦显微镜观察证明了cGAMP能在肿瘤细胞内有效释放。MTT法检测细胞毒性结果表明DOX/cGAMP@NPs对两种肿瘤细胞活性均有较高的抑制能力。该递药系统促进细胞CRT外翻、HMGB1和ATP的释放以及IFN-β、TNF-α的分泌，有效诱导BMDCs的成熟。 体内生物分布显示DiR标记的纳米颗粒比游离DiR表现出更高的肿瘤部位积聚。体内抑瘤实验中，DOX/cGAMP@NPs联合治疗组对4T1和B16-F10荷瘤小鼠的抑制作用最强，HE、TUNEL、Ki67组织学分析也显示了同样的结果，显示出最强的抗肿瘤作用。CRT免疫荧光切片显示DOX/cGAMP@NPs和DOX@NPs治疗后显著增加了体内CRT外翻，表明经该递药系统治疗后表现出高效的ICD诱导能力。对治疗后小鼠体内免疫成分分析显示，DOX/cGAMP@NPs组产生了更高的CD8+T细胞浸润,显著增加了肿瘤引流淋巴结内成熟DCs的比例。小鼠血浆中TNF-α、IFN-β表达也显著提高；同时，显著抑制了免疫抑制细胞群的增殖。 实验结论：通过纳米材料共递送ICD诱导剂（DOX）和STING激动剂（cGAMP），可以有效提高治疗药物在肿瘤部位的蓄积量，减少毒副作用。DOX在直接杀死肿瘤细胞的同时，诱导肿瘤细胞发生ICD效应，激活体内抗肿瘤免疫反应，cGAMP放大由DOX触发的免疫应答，调节肿瘤免疫抑制微环境，作为治疗黑色素瘤和三阴性乳腺癌的潜在化学免疫治疗策略具有很大应用的前景。
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