摘要
研究背景： 我国已步入中度老龄化社会，社会老龄化加快速度超出预期。衰老相关疾病成为困扰老年人的主要问题，影响老年人的身体健康乃至生命。衰老问题也一直是当代科学研究的热点和难点，对衰老的干预仍然需要寻找更加有效的策略。干细胞衰老是机体衰老的原因之一，因此延缓干细胞衰老是治疗衰老性疾病的突破点。间充质干细胞（Mesenchymalstemcells，MSCs）是来源于骨髓、脂肪等组织的成体干细胞，其在机体衰老过程中出现增殖能力降低、分化异常等衰老现象，与骨质疏松等老年病发生有关。S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosyl-L-methionine，SAM），是体内主要的甲基供体，SAM对于MSCs衰老的影响及对机体衰老的作用还未见研究报道。研究SAM对MSCs衰老的影响，不仅能推进细胞衰老和干细胞生物学的基础研究，还具有重要的临床应用潜力，有望开发出新的抗衰老策略，增强MSCs的治疗效果。 研究目的： 本研究旨在探究SAM对于体外和体内MSCs衰老的作用及其对机体衰老的影响，并进一步阐明具体的分子机制，寻找相关的信号通路。 研究方法： 1、从人的抽脂术获取的脂肪组织中提取MSCs，并进行相关抗原免疫表型的检测。使用100μMH2O2处理2h构建MSCs衰老模型，并通过β-半乳糖甘酶染色和活性氧检测等，确定SAM作用的适宜浓度。然后对衰老表征进行检测，包括衰老相关蛋白、细胞周期和MSCs的成骨成脂分化能力。 2、为了探究SAM改善MSCs衰老的分子机制，进行了转录组测序，对差异表达基因及其所富集的通路进行筛选。通过Westernblot对通路核心蛋白进行实验验证，并使用PI3K的抑制剂LY294002对细胞进行预处理，验证LY294002对SAM抗衰老作用的影响，进一步确定SAM对该通路的作用。 3、通过查阅相关文献并结合相关的数据库，我们筛选到PI3K/AKT下游的靶分子——叉头蛋白03（FOXO3a），利用Westernblot检测SAM对FOXO3a表达的影响，利用免疫荧光检测FOXO3a在细胞中的定位分布的变化，通过siRNA技术对FOXO3a的功能进行验证。 4、为了检测SAM对机体衰老的影响，构建了D-半乳糖（D-gal）诱导的小鼠早衰模型。通过行为学从整体上评估SAM的抗衰老效果，通过Westernblot和免疫组织化学技术对心肝肾中衰老指标进行检测，通过Micro-CT对小鼠股骨远端的微观结构进行评估，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）对小鼠血清中的抗氧化指标进行检测。为了进一步探究SAM对体内骨髓MSCs衰老的影响，我们构建了大鼠去卵巢骨质疏松模型。利用Micro-CT检测SAM对股骨远端骨的微观结构的影响，利用ELISA检测大鼠血清中Ⅰ型前胶原N端前肽（PⅠNP）的变化，利用HE染色和TRAP染色分别对股骨远端病理学结构和破骨细胞进行评估，利用全骨髓贴壁法对大鼠下肢骨髓腔内的MSCs进行提取，并对相关衰老指标和成骨分化能力进行评估。 研究结果： 1、SAM减轻H2O2诱导的MSCs衰老。 我们选取培养的MSCs进行免疫表型的检测，结果符合国际细胞学会对MSCs免疫表型的鉴定标准。我们使用H2O2构建MSCs衰老模型，并通过β-半乳糖甘酶染色、活性氧检测确定SAM的剂量为24h50μM和24h100μM。SAM处理24h之后，Westernblot结果显示P53和P21的表达明显下调，SIRT1的表达明显上调（P＜0.05），细胞周期实验结果显示，G2期和S期细胞比例明显上调（P＜0.01），G1期细胞比例下调（P＜0.05）。在体外对MSCs进行成骨和成脂诱导分化，油红O和茜素红染色结果显示，SAM处理6天和9天可以促进脂滴的形成和钙质的沉积。实时荧光定量PCR结果显示，SAM处理6天和9天成骨基因（runx-2）和成脂基因（lpl）表达上调（P＜0.05）。Westernblot结果显示，SAM处理6天和9天促进RUNX-2和LPL的表达（P＜0.05）。 2、SAM通过激活PI3K/AKT通路减轻氧化应激诱导的MSCs衰老。 转录组测序结果提示SAM可能通过PI3K/AKT通路发挥作用。Westernblot结果显示，SAM处理24h之后PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT的表达上调（P＜0.01）。β-半乳糖甘酶染色、活性氧水平检测、细胞周期实验和分化实验结果显示，PI3K的抑制剂LY294002可以抑制SAM的抗衰老作用（P＜0.05）。 3、FOXO3a是SAM抑制MSCs衰老和促进成骨分化的关键分子。 Westernblot结果显示，SAM处理24h之后FOXO3a的表达下调（P＜0.05），p-FOXO3a的表达上调（P＜0.01），并且这一现象可被LY294002抑制（P＜0.05）。免疫荧光结果显示，SAM处理24h之后可以抑制FOXO3a的核转位（P＜0.01）。随后，使用siRNA技术干扰FOXO3a的表达，发现FOXO3a干扰之后，P53和P21的表达降低（P＜0.001），RUNX-2的表达升高钙质沉积增多（P＜0.05）。 4、SAM在小鼠衰老模型中发挥抗衰老作用并缓解去卵巢大鼠骨质疏松模型中骨髓MSCs的衰老。 在小鼠衰老模型中，SAM灌胃治疗3周之后，行为学实验结果显示，SAM可以改善小鼠运动的耐力和距离（P＜0.01），Westernblot和免疫组化染色结果显示，SAM降低小鼠重要脏器中衰老相关蛋白的表达（P＜0.05）。Micro-CT结果显示，SAM增加小鼠股骨远端骨小梁的数量和厚度（P＜0.05）。ELISA结果显示，SAM灌胃治疗3周之后，小鼠血清中SOD和GPX的水平下调（P＜0.001），MDA水平上调（P＜0.001）。在大鼠去卵巢骨质疏松模型中，Micro-CT结果显示，SAM腹腔注射8周之后，股骨远端BV/TV和Tb.N的值明显升高（P＜0.01）。SAM治疗8周之后，HE染色结果显示，骨小梁的微观结构得到恢复，TRAP染色结果显示，N.Oc/BS的值明显降低（P＜0.001）。大鼠骨髓MSCs中β-半乳糖甘酶阳性细胞的比率降低（P＜0.001），衰老相关蛋白P53、P21和P16INK4a的表达水平下调（P＜0.05）。此外，成骨诱导分化实验结果显示，与OVX组相比，大鼠骨髓MSCs中RUNX-2的表达升高钙质沉积增多（P＜0.05）。 结论： 综上所述，SAM通过PI3K/AKT通路改善体外MSCs的氧化应激性衰老，并抑制FOXO3a的核转位。SAM可以改善D-gal小鼠衰老模型的运动能力和耐力，缓解心脏肝脏肾脏的衰老。除此之外，SAM可以改善大鼠去卵巢骨质疏松模型中骨髓MSCs的衰老，并改善其成骨分化的能力。
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