摘要
反刍动物胃肠道中栖息的微生物与宿主存在互作关系，影响反刍动物的生产效率和健康。幼龄反刍动物肠道微生物群落的建立更是对其成年后的生产性能有重要影响。反刍动物不仅胃肠道不同部位微生物群落显著不同，而且胃肠道黏膜微生物与肠腔内容物微生物显著不同。已有研究表明，源于宿主源的肠道益生菌在调控肠道微生物组成及健康中发挥重要作用。梅花鹿是我国最具经济价值的鹿科动物之一，生产珍贵中药鹿茸，而胃肠道细菌群落的组成与鹿茸的生产效率紧密相关。因此揭示幼龄梅花鹿肠道微生物发育演替规律并分离肠道微生物对幼鹿健康发育具有重要意义。 1.幼龄梅花鹿肠道黏膜微生物演替规律 本研究以1日龄、42日龄和70日龄的梅花鹿为研究对象，分别无菌采集小肠（空肠和回肠）和大肠（盲肠和结肠）黏膜样品，提取微生物DNA，进行16SribosomalRNA（16SrRNA）基因高通量测序与分析。结果表明，70日龄梅花鹿盲肠和结肠黏膜微生物的Chao1指数和Shannon指数都显著高于1日龄（P＜0.05），小肠黏膜细菌多样性显著低于大肠（P＜0.05）。主坐标分析（Principalcoordinatesanalysis，PCoA）表明小肠和大肠的黏膜细菌群落结构差异显著，1日龄梅花鹿肠道黏膜细菌群落结构与42日龄和70日龄差异显著。小肠黏膜中甲基杆菌-甲基红色杆菌属（Methylobacterium-Methylorubrum）、远洋杆菌属（Pelagibacterium）、不动杆菌属（Acinetobacter）和葡萄球菌属（Staphylococcus）的相对丰度较高，而大肠黏膜中别样杆菌属（Alistipes）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）UCG-004、Eubacteriumcoprostanoligenesgroup和未分类毛螺菌科（Lachnospiraceae）的相对丰度较高。随着年龄的增长，肠道黏膜优势细菌属由乳杆菌属、Lachnoclostridium和拟杆菌属（Bacteroides）转变为密螺旋体属（Treponema）、龙包茨氏菌属（Romboutsia）、OscillospiralesUCG-005和未分类消化链球菌科（Peptostreptococcaceae）。功能预测表明，小肠黏膜细菌的复制与修复富集，而大肠黏膜细菌的碳水化合物的代谢富集；1日龄梅花鹿肠道黏膜细菌碳水化合物代谢和脂质代谢通路的相对丰度显著高于42日龄和70日龄，氨基酸代谢和能量代谢通路的相对丰度显著低于42日龄和70日龄。以上结果表明，日龄和肠道部位显著影响梅花鹿黏膜细菌群落组成及功能。 2.幼龄梅花鹿粪便微生物及其代谢物演替规律 以上述试验动物为研究对象，无菌采集1日龄、42日龄和70日龄梅花鹿直肠粪便样品，利用16SrRNA基因高通量测序分析粪便微生物组成，利用气相色谱-飞行时间质谱（Gaschromatography-time-of-flightmassspectrometry，GC-TOF-MS）分析粪便代谢物组成。结果表明，1日龄梅花鹿粪便细菌组成与42日龄和70日龄显著不同，70日龄梅花鹿粪便细菌的操作分类单元（Operationaltaxonomicunits，OTUs）和Shannon指数显著高于1日龄（P＜0.05）。与42日龄和70日龄梅花鹿相比，1日龄梅花鹿粪便中乳杆菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactococcus）和Lachnoclostridium的相对丰度显著升高，而瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）UCG-005、瘤胃球菌科UCG-010、瘤胃球菌科UCG-014、克里斯滕森氏菌科（Christensenellaceae）R-7和Eubacteriumcoprostanoligenesgroup的相对丰度显著降低（P＜0.05）。主成分分析（Principalcomponentanalysis，PCA）表明1日龄梅花鹿粪便代谢物与42日龄和70日龄梅花鹿显著不同。1日龄梅花鹿粪便中丝氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、肌酸、异亮氨酸、半乳糖和核糖的浓度显著高于42日龄和70日龄，而皮质酮、白藜芦醇、白皮杉醇、延胡索酸、α-酮戊二酸、甘油、尿嘧啶-5-羧酸和顺丁烯二酸的浓度显著低于42日龄和70日龄。差异代谢物富集分析表明，与42日龄和70日龄相比，1日龄梅花鹿粪便中氨基酸代谢和碳水化合物代谢发生显著变化（P＜0.05）。而共有代谢物富集分析表明，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，精氨酸生物合成，乙醛酸和二羧酸代谢，柠檬酸循环和丙酮酸代谢在三个日龄均显著富集（P＜0.05）。以上研究结果表明，幼龄梅花鹿肠道细菌群落和代谢物随日龄的增长发生显著变化。 3.梅花鹿粪便微生物分离与鉴定 以反刍时期梅花鹿为研究对象，无菌采集2岁梅花鹿粪便，利用R2A、TSA、LB、BHI、CNA、BAB、MN、LBB、DC、LBS、MAG和MRS等培养基分离细菌并进行鉴定。本试验共获得235株细菌，通过聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）扩增鉴定出108株细菌。BLAST比对结果表明，108株细菌属于30个属，45个种。芽孢杆菌属（Bacillus，33.33%）、埃希氏菌属（Escherichia，9.26%）、志贺氏菌属（Shigella，8.33%）和鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium，6.48%）为优势菌属。优势菌种主要包括解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）、海恩斯氏芽孢杆菌（Bacillushaynesii）、地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）、解蛋白芽孢杆菌（Bacillusproteolyticus）、假蕈状芽孢杆菌（Bacilluspseudomycoides）、短芽孢杆菌（Bacilluspumilus）、沙福芽孢杆菌（Bacillussafensis）、堆肥芽孢杆菌（Bacillusstercoris）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、特基拉芽孢杆菌（Bacillustequilensis）、弗氏埃希氏菌（Escherichiafergusonii）、弗氏志贺氏菌（Shigellaflexneri）、奶品鞘氨醇杆菌（Sphingobacteriumalimentarium）、牦牛鞘氨醇杆菌（Sphingobacteriumbovisgrunnientis）、屎肠球菌（Enterococcusfaecium）、产黄纤维单胞菌（Cellulomonasflavigena）、芬克纤维微菌（Cellulosimicrobiumfunkei）和木糖葡萄球菌（Staphylococcusxylosus）等。以上结果表明，芽孢杆菌属是2岁龄梅花鹿粪便优势细菌，其为梅花鹿源益生菌的开发和应用提供了依据。
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