摘要
目的： 本研究旨在阐明蟾毒灵在肝内胆管癌的抗肿瘤作用和分子机制，寻找蟾毒灵的相互作用靶点，为蟾毒灵在肝内胆管癌的抗肿瘤作用提供理论意义和实验依据，使其更好地适用于临床。 方法： 细胞实验：CCK-8实验确定蟾毒灵在不同时间的半数抑制浓度（IC50）。划痕、Transwell和Westernblot实验检测肝内胆管癌细胞迁移能力及Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达水平。人类蛋白质组芯片筛选蟾毒灵的直接相互作用靶点。分子对接技术、Pulldown和BLI实验检测蟾毒灵和直接互作靶点的结合能力。生物信息学分析CAMKK2参与的生物学过程和信号通路。Westernblot、免疫荧光和免疫组化检测癌和癌旁组织CAMKK2的表达差异。过表达CAMKK2慢病毒感染肝内胆管癌细胞构建稳转细胞株，并验证感染效率。划痕、Transwell和Westernblot实验检测过表达CAMKK2后肝内胆管癌细胞迁移能力。SKL2001激活剂正反验证蟾毒灵通过Wnt/β-catenin信号通路影响肝内胆管癌的发生发展。Ca2+检测试剂盒检测Ca2+的含量变化。线粒体胞质分离实验检测在CAMKK2过表达的情况下蟾毒灵处理前后ANXA2的含量变化。透射电子显微镜检测线粒体形态的差异。 动物实验：慢病毒感染构建CAMKK2过表达QBC-939稳转细胞株。将稳转CAMKK2的QBC-939细胞接种于裸鼠腹股沟部位，构建裸鼠皮下移植瘤肝内胆管癌模型。皮下移植瘤模型构建好后将蟾毒灵腹腔注射于裸鼠皮下移植瘤模型进行治疗，确定蟾毒灵是否通过CAMKK2在体内影响肝内胆管癌的生物学进程。利用15cm尺子测量移植瘤的大小。治疗结束后将裸鼠安乐死，取出移植瘤及心、肝、脾、肺和肾等主要器官，HE染色对其进行病理学评估。Westernblot检测移植瘤中转移相关蛋白以及Wnt/β-catenin信号通路蛋白的表达。 结果： 细胞实验：蟾毒灵处理肝内胆管癌细胞24h和48h的IC50为：HCCC-9810（24h80nM，48h40nM）；RBE（24h160nM，48h80nM）和QBC-939（24h50nM，48h20nM）。划痕、Transwell和Westernblot实验表明，蟾毒灵以浓度依赖性的方式显著抑制肝内胆管癌细胞的迁移能力（p＜0.01）。人类蛋白质组芯片筛选出蟾毒灵的直接相互作用靶点CAMKK2。分子对接技术、Pulldown实验和BLI实验检测蟾毒灵和CAMKK2有较强的结合能力。生物信息学分析CAMKK2与Wnt/β-catenin信号通路显著相关。Westernblot、免疫荧光和免疫组化实验检测CAMKK2在肝内胆管癌细胞高表达。蟾毒灵显著抑制过表达CAMKK2的肝内胆管癌细胞的增殖和迁移能力。SKL2001激活剂正反验证蟾毒灵通过影响Wnt/β-catenin信号通路影响肝内胆管癌的发生发展。Ca2+检测试剂盒检测Ca2+的含量变化与蟾毒灵显著相关。线粒体胞质分离检测在CAMKK2过表达的情况下蟾毒灵处理前后ANXA2的表达量在胞质减少，在线粒体增加。透射电子显微镜检测蟾毒灵使肝内胆管癌细胞的线粒体变小以及形态皱缩。 动物实验：过表达CAMKK2的QBC-939稳转细胞构建成功。CAMKK2过表达组裸鼠的平均肿瘤体积明显大于对照组，蟾毒灵治疗后，治疗组的肿瘤体积明显缩小（p＜0.05）。HE染色结果显示，所有肿瘤均为实体瘤，蟾毒灵治疗组肿瘤组织呈大面积坏死。蟾毒灵对裸鼠的心、肝、脾、肺和肾无明显毒副作用。Westernblot结果表明，CAMKK2过表达增加了移植瘤中转移蛋白和Wnt/β-catenin信号通路蛋白的表达，而蟾毒灵能逆转这一效应（p＜0.05）。 结论： 本研究证实蟾毒灵靶向CAMKK2通过Wnt/β-catenin信号通路抑制肝内胆管癌的增殖和迁移能力并且促进线粒体功能障碍。
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