摘要
研究背景：肝细胞癌(HepatocellularCarcinoma,HCC)是全球常见的癌症之一，死亡率高居第二位。目前，在HCC诊断和治疗方面已经取得许多进展，但HCC复发率高和转移速度快，预后差的现状并未改变。探究低毒、高效的HCC治疗方式，仍然是当前癌症研究的难点。近年来，毒副作用小的天然植物抗肿瘤药物因其低耐药性、分布广的特点备受关注，在恶性肿瘤治疗中展现出较好的研究价值。研究发现，芒柄花黄素(Formononetin,FN)具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等多种药理学作用，但迄今为止，FN治疗HCC的作用以及潜在的分子机制尚未见报道。 研究目的：本研究通过网络药理学联合生物信息学技术，筛选出FN治疗HCC的相关靶点及信号通路，并通过体外实验，探究FN对HepG2细胞调控作用及机制，为HCC的治疗提供数据支持和理论依据。 研究方法： 1.网络药理学联合生物信息学分析FN治疗HCC靶点及通路 首先，通过网络药理学联合癌症基因组图谱(TheCancerGenomeAtlas,TCGA)数据库筛选出HCC差异基因。其次，通过SwissTargetPrediction等数据库预测FN潜在作用靶点。再次，对HCC差异基因和FN潜在作用靶点取交集，获取FN治疗HCC的潜在靶点。最后，通过蛋白网络互作分析筛选核心靶点，并通过GO、KEGG富集分析和分子对接进一步明确FN治疗HCC的潜在靶点及通路。 2.FN对HepG2细胞中TLR4表达的影响 为筛选出FN处理HepG2细胞的浓度与时间，采用不同浓度FN：0、10、20、40、60、80、100μmol/L分别处理HepG2细胞24h和48h后，采用CCK-8实验检测细胞存活率。基于CCK8结果确定FN处理细胞的浓度和时间分别为10μmol/L和24h。实验分组：Control组：含DMSO的培养基常规培养细胞，无其他药物处理；CLI-095组（TLR4抑制剂）：含100nmol/LCLI-095的培养基。LPS组（TLR4激活剂）：含10ng/mLLPS的培养基。FN组：含10μmol/LFN的培养基。LPS+FN组：含10ng/mLLPS+10μmol/LFN的培养基。CLI-095+FN组：含100nmol/LCLI-095+10μmol/LFN的培养基。处理24h后通过WB实验、qPCR和免疫荧光实验检测细胞中TLR4表达。 3.FN对HepG2细胞中P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT相对蛋白表达水平的影响 实验分组：Control组、CLI-095组（TLR4抑制剂）、LPS组（TLR4激活剂）、FN组、LPS+FN组以及CLI-095+FN组。处理24h后通过WB实验检测细胞中P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT相对蛋白表达水平。 4.FN对HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响 实验分组：Control组、CLI-095组（TLR4抑制剂）、LPS组（TLR4激活剂）、FN组、LPS+FN组以及CLI-095+FN组。处理24h后采用细胞集落形成实验检测各组细胞增殖情况；利用细胞划痕愈合实验检测各组细胞划痕愈合率；Transwell实验检测各组侵袭细胞数。 5.FN对HepG2细胞凋亡的影响 实验分组：Control组、CLI-095组（TLR4抑制剂）、LPS组（TLR4激活剂）、FN组、LPS+FN组以及CLI-095+FN组。处理24h后，采用倒置显微镜观察各组细胞形态变化；荧光显微镜观察4'',6-二脒基-2-苯基吲哚(4'',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色各组细胞核并观察其变化；流式细胞术检测各组细胞凋亡率；通过qPCR与WB检测各组细胞凋亡相关蛋白Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2AssociatedXProtein,Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Blymphoblastoma-2,Bcl-2)mRNA水平与蛋白水平的表达情况。 研究结果： 1.网络药理学联合生物信息学分析FN治疗HCC靶点及通路 网络药理学联合TCGA数据库筛选结果表明，FN治疗HCC潜在靶点为TLR4，主要涉及PI3K/AKT通路。 2.FN降低HepG2细胞中TLR4的表达水平 细胞免疫荧光实验、WB和qPCR的结果表明，与Control组相比，FN组细胞中TLR4荧光强度、蛋白表达和mRNA的表达水平均显著降低(P＜0.001)。并且，与CLI-095组和LPS组相比，CLI-095+FN组以及LPS+FN组TLR4的表达水平均降低(P＜0.05)。 3.FN降低HepG2细胞中P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT相对蛋白表达水平 WB实验结果表明，与Control组相比，FN组细胞P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT相对蛋白表达水平显著降低(P＜0.01)。并且，与CLI-095组和LPS组相比，CLI-095+FN组以及LPS+FN组P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT相对蛋白表达水平均降低(P＜0.05)。 4.FN抑制HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭能力 集落形成实验结果显示，与Control组相比，FN组细胞集落数目显著减少(P＜0.001)。细胞划痕愈合实验结果显示，与Control组相比，FN组细胞划痕愈合能力显著降低(P＜0.01)；Transwell实验结果显示，与Control组相比，FN组细胞穿过基质胶到达下室细胞数量显著减少(P＜0.001)。并且，与CLI-095组和LPS组相比，CLI-095+FN组以及LPS+FN组HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭能力均降低(P＜0.05)。 5.FN促进HepG2细胞的凋亡 倒置显微镜观察细胞形态实验结果显示，Control组细胞形态完整，排列紧密，细胞贴壁生长；FN组细胞皱缩，排列疏松，出现漂浮，呈凋亡状态；荧光显微镜观察DAPI染色细胞核实验结果显示，Control组细胞核呈淡蓝色，细胞核染色均匀，未出现浓染及凋亡小体，而FN组细胞核呈现浓染、畸形、碎裂并出现凋亡小体；流式细胞术结果显示，与Control组相比，FN组细胞凋亡率显著增加(P＜0.001)；WB和qPCR结果显示，与Control组相比，FN组Bax/Bcl-2比值增高(P＜0.05)。此外，与CLI-095组和LPS组相比，CLI-095+FN组以及LPS+FN组HepG2细胞凋亡程度增加及Bax/Bcl-2比值增高(P＜0.05)。 研究结论：FN治疗HCC的潜在靶点为TLR4，可能通过TLR4/PI3K/AKT信号通路影响HCC的发生发展。FN除了可以降低肝癌细胞HepG2中TLR4蛋白和mRNA的表达水平，还可以降低由激活剂LPS导致的TLR4升高，以及增强抑制剂CLI-095对TLR4的抑制水平。FN可通过抑制TLR4/PI3K/AKT信号通路影响HepG2的增殖、迁移、侵袭和凋亡。
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