摘要
大豆(Glycinemax(Linn.)Merr.)是世界范围内重要的粮食和油料作物。大豆根系是植株吸收水分及营养物质的主要器官，地下部分根系庞大才会使得地上部植株良好的生长。当土壤环境发生改变，对植株的生长产生胁迫时，大豆的根系能够最早的感应到胁迫的信号，及时将信息传递到地上部分从而启动相应的调节机制。因此，根系性状与地上部生长情况有着紧密的联系，在大豆的生长发育过程中具有至关重要的地位。发达的根系是大豆植株具有相关抗性的基础，能够加强植株对干旱胁迫的响应、对盐碱环境的耐受性以及水淹条件的承受能力等。大豆根系还有着支撑和固定植株的作用，具有发达根系的植株往往在耐密以及抗倒伏中具有较强优势。此外，大豆根系也是植株产量以及籽粒品质构成的重要因素，作物的生长是一个地上部与根系相互影响、相互促进的统一过程。 组学技术能够从基因转录开始到表达翻译的产物阐明生物某一特征的表达代谢机理，更深入的阐明生物的生命活动变化。转录组及代谢组联合分析可以实现从原因和结果两个层面探究生命现象的分子机理，为系统性的解析某一生物进程的形成及变化机制提供更多依据。由于不同大豆品种根系在形态特征、空间分布和构型上有较大的差异，研究不同基因型根系对环境变异的响应机制以及对环境的生理适应策略对大豆育种研究和作物改良具有重要意义。 本研究以野生型大豆品种吉农18（JN18）和其根系发达突变体M18及重组自交系F6为实验材料，将培养25d的幼苗根系进行了转录组及代谢组联合分析，筛选根系生长发育相关的差异基因及差异代谢物并对差异候选基因进行了相应功能验证，主要研究结果如下： （1）利用转录组分析三种大豆根系的转录水平变化，初步筛选出差异表达基因264个；GO和KEGG富集分析发现，显著富集的通路主要是次生代谢物的生物合成（41个DEGs）、植物激素信号转导（37个DEGs）、苯丙烷类生物合成（34个DEGs）、植物-病原体相互作用（32个DEGs）、淀粉和蔗糖代谢（29个DEGs）、代谢通路（24个DEGs）、脂肪酸代谢（14个DEGs）、苯丙氨酸代谢（11个DEGs）、不饱和脂肪酸的生物合成（8个DEGs）、黄酮类生物合成（5个GEGs）、α-亚麻酸代谢（3个DEGs）等。 （2）广泛靶向代谢组分析得到含量显著差异的代谢产物387个。进一步对差异表代谢物进行功能富集分析，将差异代谢物分为16个主要类别，包括：氨基酸衍生物（53个DAMs）、氨基酸（47个DAMs）、植物激素（44个DAMs）、糖类（38个DAMs）、醇类和多元醇（33个DAMs）、有机酸及其衍生物（27个DAMs）、黄烷酮（22个DAMs）、生物碱（18个DAMs）、脂质-脂肪酸（17个DAMs）、核苷酸及其衍生物（12个DAMs）、异黄酮（10个DAMs）、胆碱类（7个DAMs）、脂质-甘油酯（5个DAMs）、黄酮（3个DAMs）、儿茶素及其衍生物（3个DAMs）及其他。 （3）转录组和代谢组联合分析获得了22个代谢通路，其中组氨酸代谢通路、泛酸和CoA合成通路显著富集。另外，有18个代谢通路中的35个基因都分别与天冬氨酸、脯氨酸和谷氨酸的合成代谢相关联，我们推测这些代谢通路中的差异基因或代谢物质可能是大豆根系生长发育的关键因素。根据联合分析的结果，初步筛选了大豆根系生长发育相对应的两个显著富集通路，组氨酸代谢通路、泛酸和CoA合成通路中的4个关键基因，分别是大豆醛脱氢酶家族基因（GmALDH2B4、GmALDH2B8）、大豆ATP磷酸核糖基转移酶（GmATP-PRT）、大豆脱磷酸辅酶A激酶（GmDPCK）分别与谷氨酸、天冬氨酸的关联。对候选基因进行荧光定量PCR验证，鉴定结果与转录组结果一致。 （4）利用同源PCR技术从大豆中克隆了四个候选基因的开放阅读框，片段长分别为GmALDH2B4（1356bp）、GmALDH2B8（1611bp）、GmATP-PRT（1107bp）、GmDPCK（711bp）。成功构建了目的基因过表达载体pCAMBIA3301-GmALDH2B4、pCAMBIA3301-GmALDH2B8、pCAMBIA3301-GmATP-PRT、pCAMBIA3301-GmDPCK及基因编辑表达载体pCBSG015-GmALDH2B4、pCBSG015-GmALDH2B8、pCBSG015-GmATP-PRT、pCBSG015-GmDPCK。生物信息学分析表明，四个基因具有完整二级结构及复杂的三级结构。GmALDH2B4、GmALDH2B8、GmATP-PRT编码的蛋白表现均为疏水性蛋白，GmDPCK编码亲水性蛋白。通过农杆菌介导法将四个候选基因的表达载体转入大豆品种吉农74、吉农75中，经过基因组水平的分子检测，分别获得了转基因阳性植株包括：T0代转GmALDH2B4基因过表达植株4株，基因编辑植株3株；转GmALDH2B8基因过表达植株4株，基因编辑植株3株；转GmATP-PRT基因过表达植株3株，基因编辑植株3株；转GmDPCK基因过表达植株3株，基因编辑植株3株，以上阳性转化株系均加代培养至T2代。 （5）候选基因的抗旱性鉴定与功能分析表明，在干旱胁迫条件下，四个候选基因过表达株系的种子萌发率均极显著高于对照株系。随着干旱时间的延长，叶片相对含水量逐渐流失，过表达株系的叶片相对含水量均高于对照株系；基因编辑表达株系的叶片相对含水量均低于对照株系。经48小时干旱胁迫后四个候选基因过表达株系的超氧阴离子积累量均极显著低于对照株系；叶片的NBT染色表型变化出现了明显的蓝斑面积差异，过表达株系＜对照株系＜基因编辑株系；叶绿素含量均极显著高于对照株系；幼根中MDA含量均极显著低于对照；幼根中SOD、POD含量均极显著高于对照。干旱胁迫14d后，四个候选基因过表达株系总根长、总根体积、总分叉数、根平均直径、平均连接表面积、幼根的总分叉数等指标均极显著或显著高于对照株系。经qRT-PCR分析表明，四个候选基因过表达株系平均相对表达量均有显著提高，且在基因编辑株系中基因相对表达量均有明显降低。这些结果表明，本研究挖掘到的四个候选基因可能参与大豆的根系生长发育并且能够提高大豆植株的干旱胁迫响应能力。本研究提高了人们对大豆干旱胁迫耐受机制的理解与认知，对大豆根系的生长发育以及抗旱机理研究有一定的理论指导意义。
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