摘要
布鲁氏菌（Brucella）是一类革兰阴性兼性胞内寄生菌，能够引起广泛的人畜共患传染病。在布鲁氏菌黏附并侵入宿主细胞后，绝大多数的布鲁氏菌能够被吞噬溶酶体杀死，但还有少部分布鲁氏菌通过自身毒力因子调节宿主细胞多种信号通路，进行免疫逃逸，在宿主体内建立慢性感染。巨噬细胞作为一种重要的免疫细胞和抗原递呈细胞，能够在不同微环境和细胞因子的作用下分化成不同的表型，即促进炎症的M1型巨噬细胞和抑制炎症的M2型巨噬细胞，这个过程称为巨噬细胞极化。M2型巨噬细胞能够引起Janus激酶的激活，进而导致转录激活子3（STAT3）的激活，STAT3作为调控巨噬细胞M1/M2极化的关键转录因子。 布鲁氏菌的胞内存活和增殖依赖于功能性VirB系统，由VirB操纵子编码的IV型分泌系统（T4SS），作为布鲁氏菌的重要毒力因子之一，BtpB作为T4SS效应蛋白之一，具有引起细胞内促炎因子高度表达的特征，具有复杂的调控机制。本研究以RAW264.7作为细胞模型，应用B.suisS2、ΔbtpB、C-ΔbtpB进行侵染，通过流式细胞术、RT-qPCR、Westernblot和免疫组化等技术，检测布鲁氏菌BtpB对RAW264.7细胞极化的影响；进一步通过抑制和过表达STAT3，研究布鲁氏菌在诱导巨噬细胞极化过程中STAT3的作用。试验结果如下： 1.布鲁氏菌BtpB诱导RAW264.7细胞向M1/M2型极化，将B.suisS2、ΔbtpB、C-ΔbtpB侵染RAW264.7细胞，ΔbtpB促进M1型极化因子IL-6、TNF-α、NOS2在4h、24h发生显著上调（plt;0.001），M2型极化因子IL-10、TGF-1β、Ppar-γ下调（plt;0.05）；免疫荧光检测发现ΔbtpB导致NOS2表达上调；流式细胞术检测ΔbtpB组中CD86占比高于CD206（plt;0.05）；小鼠感染试验结果显示，ΔbtpB组脾脏细胞在感染第1周时NOS2表达上调，第2周中三株菌株均高于Control，但组内差异不显著。同时布鲁氏菌侵染导致巨噬细胞代谢改变，在1h时上清中葡萄糖含量减少，细胞摄取增加，4h时乳酸分泌增多。结果表明，布鲁氏菌效应蛋白BtpB促进巨噬细胞M2极化。 2.Westernblot和免疫荧光试验证明，布鲁氏菌效应蛋白BtpB促进STAT3的表达；抑制STAT3导致B.suisS2、C-ΔbtpB组中NOS2表达上调（plt;0.05），与ΔbtpB组不存在差异；mRNA水平结果与上述结果一致。过表达STAT3导致B.suisS2、ΔbtpB、C-ΔbtpB组NOS2均发生表达下调（plt;0.05），使用ELISA检测上清中IL-10表达，显示在4h和24h时，转染组ΔbtpB相较于未转染组IL-10发生了显著上调（plt;0.05），转染组中IL-10均发生了显著上调。证明STAT3参与布鲁氏菌BtpB对RAW264.7细胞M2极化的促进作用。抑制STAT3活性，对布鲁氏菌胞内增殖有显著影响。结果表明，布鲁氏菌BtpB通过STAT3调控RAW264.7细胞M2型极化。 综上所述，本研究揭示布鲁氏菌BtpB促进RAW264.7细胞向M2型极化，并调控STAT3的表达影响巨噬细胞极化，为进一步完善布鲁氏菌慢性感染机制奠定基础。
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