摘要
蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）是一种广泛存在于环境中的革兰氏阳性芽孢形成细菌，常见于土壤、食品以及人类肠道菌群中。这种细菌能够产生多种毒素，引起食源性中毒，表现为恶心、呕吐和腹泻等症状。在某些罕见的情况下，蜡样芽孢杆菌还可能引起更严重的疾病，如肺炎、脑膜炎、败血症等。由于其在食品安全领域的重要性，对蜡样芽孢杆菌的鉴定和分型尤为关键。传统的生化分型方法依赖于细菌的生理和代谢特性，如糖发酵能力和酶耐性测试等。然而，生化分型往往耗时且有些蜡样芽孢杆菌菌株无法分型。相比之下，分子分型通过分析基因序列和遗传多样性，可以揭示不同菌株之间的细微差异。结合靶点的PCR验证，分子分型技术在复杂的菌群环境中能够实现快速、准确的检测和鉴定，为食品安全和公共卫生提供了强有力的技术支持。目前已有研究将蜡样芽孢杆菌的毒素基因和特定的管家基因作为靶点对其进行种内鉴定，但有些靶点的特异性较差。特异基因靶点发掘的目的在于提高蜡样芽孢杆菌检测的特异性和灵敏度，确保检测结果的准确性。通过发掘蜡样芽孢杆菌特有的基因或基因片段，可以避免与其他近缘种，如苏云金芽孢杆菌的混淆，从而提高食品安全监管和公共卫生应对的有效性。因此，本研究以柿源样品中的分离出的蜡样芽孢杆菌为研究对象，结合生化鉴定、panC基因分析和多位点序列分型（MLST）技术，分析蜡样芽孢杆菌分离菌株的系统发育关系，探究柿源中蜡样芽孢杆菌的遗传多样性和不同菌株间的遗传差异；同时建立蜡样芽孢杆菌CC142型（ClonalComplex）菌株和非CC142型菌株的基因组库，利用比较基因组学的方法从蜡样芽孢杆菌ATCC14579的序列中发掘并筛选特异性基因靶点，并在柿源蜡样芽孢杆菌CC142型菌株和非CC142型菌株进行PCR验证。主要研究内容和结果如下： （1）柿源蜡样芽孢杆菌的分离鉴定和MLST分型。从90份柿源（包括柿果、柿叶和土壤）样品中分离出45株蜡样芽孢杆菌疑似菌株，通过生化鉴定、panC基因分析和MLST方法，将45株分离菌株鉴定为蜡样芽孢杆菌。所有分离菌株被分成groupⅡ、groupⅢ、groupⅣ和groupⅤ等4个系群发育群。进一步利用MLST技术将45株蜡样芽孢杆菌分离株分成23个序列型（STs）和4个克隆复合体（CCs），其中CC142是柿源蜡样芽孢杆菌分离株的优势CC型。系统发育分析结果表明，这23个ST型主要分为2个系统发育群，分离菌株与蜡样芽孢杆菌ATCC14579显示了更近的系统发育关系。最小生成树分析结果显示，在柿果、柿叶和土壤样品中均分离到ST-1237型菌株，其中土壤样品中包含的ST型最多（10/23，43.48%），其次为柿果（7/23，30.43%）和柿叶（2/23，8.70%）。 （2）柿源蜡样芽孢杆菌携带毒力基因检测。对45株蜡样芽孢杆菌分离株的腹泻型毒素（Hbl、Nhe、CytK、BceT、EntFM）的相关基因和呕吐型毒素基因ces和EM1进行了检测。结果显示，编码肠毒素Nhe的基因nheA和nheB检出率最高，分别为100.0%和88.89%，而肠毒素基因hblA、hblC、hblD、nheC、cytK、bceT和entFM的检出率分别为11.11%、84.44%、82.22%、71.11%、100.0%、88.89%、24.44%、66.67%和86.67%，仅有2株分离株检出基因ces和EM1，这表明从柿源样品中分离出的携带腹泻型毒素基因的菌株比携带呕吐型毒素基因的菌株更为常见；分离菌株携带毒力基因的模式可以分成20个型，其中基因型1是主要的基因型（11/20，55%），同时携带hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、bceT和entFM基因。此外，groupIV型柿源分离菌株均携带4个以上的Hbl和Nhe毒素基因。 （3）蜡样芽孢杆菌特异靶点的筛选与PCR验证。将蜡样芽孢杆菌ATCC14579作为代表菌株建立CC142型菌株的基因组库，将其基因组序列切割成为497bp的DNA片段，并与数据库中其它11株非CC142型蜡样芽孢杆菌的基因组序列进行比对。将发掘到的31个DNA片段作为候选靶点进行PCR验证。结果表明，候选靶点BS-4948、BS-4949和BS-6050只从柿源中分离出的CC142型菌株DNA模板扩增出特异产物，而非CC142型菌株的DNA模板没有扩增产物。因此，BS-4948、BS-4949和BS-6050可以作为三个蜡样芽孢杆菌的特异性靶点。
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