摘要
苹果（Malusdomestica）在全球范围内广泛种植，具有极高的经济价值。黄土高原是我国最大的苹果产区，但再植病和干旱严重制约着该区苹果产业的高质量发展。腐皮镰孢菌（Fusariumsolani，Fs）是引起我国苹果再植病的主要致病菌，LysM类受体激酶CERK1广泛参与了植物免疫反应，但其在植物抵御死体营养型病原菌中的功能尚不明确；ABA信号通路在植物抗旱过程中起重要作用，研究发现CERK1的同源基因LYK3参与调控ABA信号传导，但其作用机制有待进一步解析。鉴于此，本研究分别探究了MdCERK1和MdLYK3在苹果抵御Fs侵染和干旱胁迫过程中的功能和调控机制，旨在为改良苹果的再植病和干旱抗性提供基因资源和理论依据。主要研究结果如下： 1.MdCERK1通过抑制茉莉酸（Jasmonate,JA）生物合成削弱苹果对腐皮镰孢菌的抗性。 （1）MdCERK1通过调控JA合成影响Fs抗性。过表达MdCERK1的苹果毛状根在Fs侵染下JA含量降低，对Fs的抗性减弱，外源补充JA可恢复其抗性；干扰MdCERK1表达的苹果毛状根在Fs侵染下JA含量升高，对Fs的抗性增强，添加JA合成抑制剂DIECA会降低其抗性，表明JA在MdCERK1调控的Fs抗性中发挥重要作用。 （2）MdCERK1靶向并磷酸化修饰JA生物合成关键酶MdLOX2.1。酵母双杂交、双分子荧光互补试验（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）等发现MdCERK1能够与JA生物合成关键酶MdLOX2.1相互作用。通过LC-MS和体内外磷酸化分析发现，MdCERK1能磷酸化修饰MdLOX2.1的Ser326和Thr327位点，且该修饰受几丁质诱导。 （3）MdLOX2.1的磷酸化导致其亚细胞定位改变，继而影响其JA合成能力。过表达MdLOX2.1促进了的苹果植株中JA的积累，增强了植株对镰孢菌的抗性。与对照组相比，过表达MdLOX2.12A（Ser326和Thr327均突变为A）的苹果毛状根中JA含量提高，对Fs抗性更强，而过表达模拟磷酸化型MdLOX2.12D（Ser326和Thr327均突变为D）的苹果毛状根中JA含量降低，对Fs的抗性降低。JA的合成部位为叶绿体，亚细胞定位分析显示，MdLOX2.1的磷酸化修饰抑制了MdLOX2.1从细胞质到叶绿体的转运，因而阻碍了JA的生物合成。 2.MdWRKY71是MdCERK1的转录抑制因子，MdCERK1引起的JA水平降低促进了MdWRKY71的转录和蛋白修饰。酵母双杂交、Co-IP和双荧光素酶互补成像（LCI）等发现MAP激酶MdMMK2与MdWRKY71相互作用，并磷酸化修饰MdWRKY71的Thr99和Thr102残基，且这种相互作用和磷酸化均受到低浓度的JA诱导。MdMMK2介导的MdWRKY71磷酸化增强了其对MdCERK1的转录抑制作用。 3.MdLYK3通过抑制ABA信号转导削弱苹果的抗旱能力。 （1）MdLYK3与PP2C竞争性结合PYLs，抑制ABA信号转导。过表达MdLYK3的苹果愈伤组织对ABA敏感性降低。在干旱胁迫下，病毒诱导的MdLYK3沉默促进了ABA诱导的气孔关闭，减缓了干旱胁迫下叶片的失水速率，增强了苹果对ABA的响应能力，提高了苹果植株的抗旱性。酵母双杂交和BiFC分析发现MdLYK3能够与ABA受体相互作用，并与PP2C竞争性结合PYLs，使PYLs从PYLs-ABA-PP2C复合体中解离，抑制ABA信号转导。 （2）MdLYK3磷酸化MdPYL4和MdPYR1。MdPYL4和MdPYR1的磷酸化减弱了其对ABA信号的的应答，此外，MdPYL4和MdPYR1的磷酸化加剧了其泛素化，继而降低了其蛋白稳定性。在MdLYK3的沉默组织中，MdPYL4和MdPYR1的泛素化水平降低，稳定性增强。无细胞系蛋白降解试验发现，MdLYK3对MdPYL4和MdPYR1的磷酸化加速了其经由26S蛋白酶体途径降解，进而抑制ABA信号转导。 综上所述，MdCERK1与MdLOX2.1相互作用，并对其Ser326和Thr327位点磷酸化，阻碍MdLOX2.1的叶绿体定位，导致JA合成受阻。低水平的JA通过激活苹果MdMMK2-MdWRKY71模块来抑制MdCERK1表达，以恢复JA生物合成。MdLYK3一方面与PP2C竞争性结合ABA受体，使其从ABA信号的核心复合物PYL-ABA-PP2C中解离，另一方面磷酸化MdPYR1/MdPYL4，促使其泛素化降解，从而阻断ABA信号转导。本研究丰富了苹果中LysM类受体激酶调控Fs和干旱胁迫抗性的功能，为苹果抗再植病和抗旱遗传改良提供了基因资源并奠定了理论基础。
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