摘要
研究背景：胰腺癌是导致人类死亡的第三大常见癌症，5年生存率为10%。恶性胰腺癌不仅能够无限制地分裂和增殖，还能够逃避身体免疫系统的监测和攻击，这进一步加剧了疾病的恶性程度。此外，胰腺癌细胞具有高度转移性，易发生早期转移且治疗手段有限。而黄酮类化合物作为一种天然产物，通过直接或间接靶向多种信号通路，抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移，对胰腺癌起到治疗作用。因此，小豆蔻明（Cardamonin，CAR）作为一种黄酮类单体，研究胰腺癌发生发展的通路机制可能有助于探索天然产物治疗胰腺癌的有效方法。 目的：以胰腺癌细胞PANC-1和BxPC-3为研究对象，观察小豆蔻明对人胰腺细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响，并找到CAR作用于胰腺癌细胞的相关通路以及潜在的分子机制，为胰腺癌的治疗提供新的治疗策略。 研究内容：(1)CAR对胰腺癌细胞PANC-1和BxPC-3中对增殖活力的影响。(2)CAR对胰腺癌细胞PANC-1和BxPC-3中迁移能力和侵袭能力的影响。(3)CAR对胰腺癌细胞PANC-1和BxPC-3凋亡的影响。(4)CAR对胰腺癌细胞PANC-1相关间质蛋白表达的影响。(5)CAR对裸鼠皮下移植瘤模型肿瘤以及肝转移的影响。(6)CAR对胰腺癌细胞PANC-1和BxPC-3的转录组分析。 方法：(1)CAR分别处理胰腺癌细胞PANC-1和BxPC-3，不同时间（24h、48h和72h），利用倒置显微镜观察CAR对胰腺癌细胞形态的影响。(2)CCK8实验检查CAR对胰腺癌细胞增殖的影响。(3)划痕实验、Transwell迁移与侵袭实验检测CAR对胰腺癌细胞迁移、侵袭能力的影响。(4)流式细胞实验检测CAR对胰腺癌细胞凋亡的影响；(5)Westernblot实验，研究CAR对胰腺癌细胞PANC-1发生上皮间质转化（Epithelial-mesenchymaltransition，EMT）关键蛋白的影响；(6)急性毒性实验，研究CAR作用于小鼠的毒副作用的影响；(7)建立胰腺癌CDX移植瘤模型，研究CAR对移植瘤的影响；(8)建立胰腺癌CDX肝转移模型，研究CAR对胰腺癌肝转移的影响；(9)RNA抽提质检，确定12组胰腺癌细胞的样本的建库要求；(10)测序数据质控，确定12组胰腺癌细胞样本的序列质量；(11)mRNA表达分析，利用火山图分析在胰腺癌细胞中，DMSO对照组与CAR给药组之前的差异基因，分析两种胰腺癌细胞之间的差异基因；利用Venn图，对两种胰腺癌细胞以及给药前后的差异基因进行分析；(12)差异基因富集分析，对CAR作用于胰腺癌细胞差异基因进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析。 结果：(1)倒置显微镜观察结果显示，CAR作用胰腺癌细胞PANC-1和BxPC-3后，出现不同程度的细胞形态变化，包括细胞变圆、胞质缩小以及细胞间连接消失等；CCK8实验结果显示，CAR可以抑制胰腺癌细胞的增殖能力。(2)划痕实验实验结果显示，CAR可以抑制胰腺癌细胞的迁移能力；Transwell迁移实验结果与ranswell侵袭实验结果显示，CAR可以抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力。(3)流式细胞凋亡（AnnexinV/PI双染）实验结果显示，CAR可以促进胰腺癌细胞的凋亡与坏死。(4)Westernblot实验结果显示，CAR可以抑制胰腺癌细胞PANC-1的间质细胞表型相关指标的表达，包括N-cadherin，Vimentin，MMP9。(5)急性毒性实验结果显示，320mg/kgCAR给药组对裸鼠的生存率及体重无明显差异；HE实验结果显示，小鼠心、肝、脾、肺、肾以及脑组织这些重要脏器无明显改变，证明后续动物实验可行。(6)CAR作用于裸鼠皮下移植瘤模型一般情况结果显示，DMSO对照组与20mg/kgCAR给药组之间的裸鼠生存周期及裸鼠体重无明显改变；HE染色结果表明，裸鼠的心、脾、肺、肾等重要组织无明显差异，瘤体组织的核质比也无明显差异；(7)CAR作用于裸鼠皮下移植瘤模型的结果显示，与DMSO对照组相比，20mg/kgCAR给药组裸鼠瘤体明显变小。(8)CAR作用于裸鼠皮下肝转移模型的结果显示，与DMSO对照组相比，20mg/kgCAR给药组裸鼠肝脏转移灶的数量明显减少。(9)RNA抽提质检结果显示，12组胰腺癌细胞的样本满足建库要求。(10)测序数据质控结果表明，12组胰腺癌细胞的样本序列质量较高，满足后续的生物信息分析。(11)mRNA表达分析结果，在CAR作用于胰腺癌细胞PANC-1和BxPC-3的火山图中，表明胰腺癌细胞PANC-1和BxPC-3中，DMSO对照组与12.5μMCAR给药组之前存在差异基因，表明这两种胰腺癌细胞之间存在差异基因；利用Venn图对所有差异基因分析，表明CAR作用于胰腺癌细胞PANC-1和BxPC-3后共存在115个差异基因。(12)差异基因富集分析，对CAR作用于胰腺癌细胞PANC-1和BxPC-3差异基因进行GO、KEGG富集分析，未发现两株胰腺癌细胞存在特异性通路；对CAR作用于胰腺癌细胞PANC-1和BxPC-3的所有差异基因进行富集分析，找到两株细胞之间的共同差异表达基因，主要富集在细胞周期相关基因。 结论：CAR可以抑制胰腺癌的增殖，促进胰腺癌细胞的凋亡；CAR可以在细胞水平抑制胰腺癌细胞的转移和侵袭；CAR可以降低胰腺癌细胞PANC-1的间质细胞表型相关指标的表达；CAR可以抑制裸鼠胰腺癌皮下移植瘤的增殖与转移；CAR可以改变胰腺癌细胞的基因表达，其共同差异基因主要富集在与细胞周期相关的基因。
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