摘要
肠道共生菌在猪的健康和生产中扮演重要角色，食淀粉乳杆菌（Lactobacillusamylovorus）是猪肠道丰度最高的共生菌之一，对饲料的改变具有强烈的响应，可以作为猪肠道微生态区系稳态的标记菌种。肠道共生菌的生理功能具有菌株特异性，因此对L.amylovorus的认识应该上升到菌株水平。然而，目前在菌株水平开展肠道共生菌的研究存在方法学挑战，主要原因是缺乏有效的与功能结构相关联的基因和蛋白标志物，致使菌株无法被有效分类。近年来，研究发现细菌S层（蛋白）在种内和种间具有丰富的多样性，并且L.amylovorus具有S层（蛋白），因此，以S层蛋白为标志物开展L.amylovorus的种内差异菌株研究是一个可行的策略。本研究以S层蛋白为筛选指标，从关中黑猪肠道分离和鉴定L.amylovorus菌株，并通过S层蛋白特异性PCR、高分辨率SDS-PAGE、全基因组测序和S层蛋白质谱（LC-MS）对分离菌株进行分析，探索关中黑猪肠道L.amylovorus菌株多样性及其分布规律，并进一步研究L.amylovorusS层蛋白的表达逻辑和多样性现象。结果如下： 试验一关中黑猪十二指肠L.amylovorus差异菌株库的建立 本试验从关中黑猪十二指肠分离获得411株L.amylovorus菌株，采用菌体S层蛋白高分辨率SDS-PAGE、全基因组测序和S层蛋白质谱分析等方法进行分析。结果显示L.amylovorus基因组中均具有多个S层蛋白注释基因，但仅有两个S层蛋白基因被选择性表达，且表达量迥异。以高表达S层蛋白作为差异菌株分类标记，关中黑猪十二指肠的411株L.amylovorus菌株可分为10种差异菌株类型。此外，本试验从关中黑猪十二指肠挑选5760株乳酸菌，进行菌落形态、菌体显微形态、菌体S层蛋白高通量SDS-PAGE等分析，建立了菌落形态与具有S层蛋白菌株的关联，发展了一套基于S层蛋白的关中黑猪肠道L.amylovorus高通量筛选体系。 试验二关中黑猪各肠段L.amylovorus差异菌株分布规律研究 为了探索关中黑猪各肠段L.amylovorus差异菌株分布规律，本试验通过高通量筛选体系，从关中黑猪的十二指肠、空回肠、盲肠和结直肠四个肠段分离10500株L.amylovorus菌株，结果显示各肠段均检测到10种差异菌株，但同一肠段内差异菌株之间的相对丰度表现显著差异。进一步分析L.amylovorus的10种差异菌株在肠段间的变化规律和菌株群特征，结果显示10种差异菌株相对丰度在肠段间呈现动态变化，其中HZS22、HZS23、HZS112、HZS114、HZS123、SPD121等6种差异菌株变化显著，特别是十二指肠至空回肠、盲肠以及结直肠，相对丰度最高的差异菌株由HZS123类演替为SPD121类，且其他差异菌株丰度次序也发生变化，使菌株群在肠段间呈现非物理性隔离生态位的分布特征。此外，本试验在结直肠获得了十二指肠未分离到的6种新的差异菌株类型（SPR527、SPR800、SPR1000、XPR24、XPR96、GPJ53），显示了前后肠段菌株群的差异。 试验三L.amylovorusS层蛋白表达岛的特性研究 本试验通过对关中黑猪肠道L.amylovorusS层蛋白选择性表达现象的系统分析，首次发现了L.amylovorus基因组中S层蛋白对称型和非对称型表达岛结构，发现S层蛋白的表达受表达岛调控。利用表达岛的结构特征，本试验对NCBI数据库L.amylovorus基因组表达岛进行了注释，结果表明：L.amylovorus基因组均存在S层蛋白表达岛结构。进一步对表达岛相关S层蛋白氨基酸序列一致性聚类分析，本试验发现L.amylovorus表达岛的高表达和沉默S层蛋白基因具有多样性，低表达S层蛋白则具有保守性。此外，本试验发现关中黑猪肠道L.amylovorus部分差异菌株基因组S层蛋白表达岛亚型与NCBI数据库中L.amylovorus基因组的不同，表明关中黑猪肠道L.amylovorus与宿主之间存在特定的共进化关系。 综上所述，本研究基于S层蛋白的多样性，展示了关中黑猪肠道L.amylovorus种内差异菌株的多样性面貌，揭示了关中黑猪不同肠段的L.amylovorus差异菌株的分布规律。此外，本研究还发现了L.amylovorus基因组S层蛋白表达岛结构，阐明了S层蛋白选择性表达的底层逻辑和S层蛋白基因多样性的特征。这些结果为L.amylovorus作为猪肠道微生态区系稳态的标记菌提供了坚实的基础，并为从菌株水平开展肠道共生菌与宿主互作研究提供了新的视角和方法。
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