摘要
叶绿体基因组是植物全基因组的重要组成部分。与核基因组相比，叶绿体基因组结构简单、长度较小、序列保守、基因进化速率适中，因此，近年来成为比较基因组学、系统发育、物种鉴定和群体遗传多样性研究的重要对象和数据来源。红豆杉是红豆杉科红豆杉属植物的统称，是世界公认的濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物，被列为我国一级重点保护野生植物。开展红豆杉树种叶绿体遗传信息的研究，对于有效保护这一珍稀濒危树种具有积极的作用。 本研究利用第二代高通量测序技术和基于参考基因组的叶绿体基因组装技术，测定并组装了我国分布较为广泛的红豆杉（Taxuschinensis）、东北红豆杉（T.cuspidata）、西藏红豆杉（T.wallichiana）和云南红豆杉（T.yunnanensis）的叶绿体全基因组序列，绘制了其叶绿体基因组图谱，利用生物信息学手段开展了4个树种的叶绿体基因组比较和红豆杉属植物的系统进化研究，并开发了基于叶绿体基因组的用于我国红豆杉树种鉴定的SSR引物和DNA条形码，取得以下主要结果： 1.通过IlluminaHiseq2500二代测序平台进行PE150高通量测序，利于MITObim软件组装获得了红豆杉（T.chinensis）、东北红豆杉（T.cuspidata）、西藏红豆杉（T.wallichiana）和云南红豆杉（T.yunnanensis）4个树种完整的叶绿体基因组，组装平均覆盖率分别为170、140、177.7、167倍，其基因组大小分别为127,743bp、128,094bp、128,092bp和128,545bp，GC含量分别为34.7%、35.1%、35.0%和34.8%。除红豆杉编码112个基因，缺失trnP-GGG外，其他3个树种均编码113个基因，但4个树种均比南方红豆杉（T.chinesisvar.mairei）少3个tRNA基因。 2.红豆杉、东北红豆杉、西藏红豆杉、云南红豆杉和南方红豆杉叶绿体基因组蛋白编码基因和rRNA基因高度保守，基因种类和数量完全一致，82个蛋白编码基因在树种之间的差别主要体现在内含子方面。但tRNA基因种类、拷贝数及内含子在5树种中存在差异。5个红豆杉树种叶绿体基因组均缺失了psbZ、psbG、rps16和ycf15基因。 3.上述5个红豆杉树种叶绿体基因组均无典型的四区结构，反向重复区（IRs）严重缩短至102bp-217bp之间。与较原始的台东苏铁（Cycastaitungensis）相比，5个红豆杉树种的叶绿体基因组在rps8和accD区段、ycf2和trnH-GUG区段发生了基因倒置，倒置后的区段发生了基因重排。叶绿体基因组重复序列的数量和分布在树种之间是相似且保守的，大片段重复以Rt重复最为丰富，多出现在基因间隔区。SSRs以单核苷酸重复为主，未发现四核苷酸和五核苷酸重复，43.5%的SSRs位于8个基因的CDS中。 4.红豆杉属树种叶绿体基因组编码序列和非编码序列的进化模式不同。编码序列的系统发育不支持“南方红豆杉是红豆杉的变种”这一观点，南方红豆杉和云南红豆杉属同一分枝，而红豆杉、东北红豆杉和西藏红豆杉则属另一个分枝。但在非编码序列的系统发育中，这5种红豆杉树种起源于一个单系进化枝。 5.插入/缺失导致的移码突变是红豆杉树种叶绿体蛋白编码基因进化负选择的主要因素，串联重复序列对红豆杉树种的叶绿体基因组扩张贡献最大。在18个红豆杉属树种中共鉴定了1128个插入和1094个缺失事件、395个重复序列。插入、缺失、单核苷酸变异每百万年的发生频率分别是8.8、7.5和32.8次，发生频率与分支长度显著相关。约有22%的叶绿体基因受正向选择影响，大多数与蛋白质翻译和光合系统有关。串联重复、反向重复和分散重复序列的比例分别为71.4%、23.8%和4.8%，三类重复序列代表红豆杉属叶绿体基因组不同的进化方式。 6.分子年代测定与地理起源重建表明，红豆杉属起源于晚白垩纪的北美州，欧洲优势种和东亚种有更近的亲缘关系，欧亚大陆的物种形成是中新纪的3次括散和2次隔离造成的。在约67.08Mya，红豆杉属和白豆杉属（Pseudotaxus）分离，29.03Mya，红豆杉属主要树种开始分化，红豆杉、东北红豆杉、西藏红豆杉和云南红豆杉的crown分支出现在13.04Mya。在10.22Mya，东北红豆杉与红豆杉/西藏红豆杉分离。4.85Mya，红豆杉与西藏红豆杉分离。 7.Hds2-4、Hds2-6、Hds2-7、Hds3-3、Hds6-1、Hds6-2等6对叶绿体基因组SSR核心引物组合可以鉴别我国主要红豆杉树种，最有效的核心引物是Hds2-6和Hds6-1，以该组核心引物构建的SSR指纹图谱树种鉴定率置信区间为99.59%-99.99%。rpl32和rbcL序列可作为我国主要红豆杉树种鉴别的叶绿体基因DNA条形码，rpl32序列大小为314-315bp，有8处碱基位点变异，rbcL序列大小为1427-1428bp，有19处碱基位点变异。 研究结果丰富了红豆杉科及裸子植物叶绿体基因组遗传信息，揭示了我国红豆杉树种叶绿体基因组特征和世界范围红豆杉属植物的叶绿体基因组进化全貌，提供了红豆杉树种鉴定的分子手段，对该珍稀濒危树种遗传资源的科学保护和合理开具有重要的应用价值。
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