摘要
我国是苹果（Malusdomestica）的起源中心之一，也是世界上苹果种植规模和产量最大的国家。黄土高原地区光照充足、昼夜温差较大，是我国优质苹果生产基地。由于全球变暖，致使该地区干旱少雨和夏季高温天气进一步加剧，干旱和热胁迫是影响该产区苹果生长发育的两个重要逆境因子。培育抗旱和耐热的苹果新种质是解决该问题的关键。因此，挖掘和鉴定苹果抗旱和耐热基因，探究其应答干旱和热胁迫的调控机制，结合育种技术培育抗旱和耐热苹果新种质，对该地区苹果产业的健康发展提供理论依据。课题组前期从干旱胁迫的转录组中鉴定到一个响应干旱的WRKY转录因子MdWRKY75，qRT-PCR分析表明其受干旱和热胁迫诱导上调表达。在此基础上，本研究通过遗传转化获得MdWRKY75的过表达和RNAi苹果植株并对其进行干旱胁迫和热胁迫处理验证了其在响应两种逆境中的功能，通过一系列生理生化试验探究了MdWRKY75在调控苹果响应干旱和热胁迫的分子机制。主要研究结果如下： 1.MdWRKY75正调控苹果对干旱胁迫的抗性。干旱胁迫处理后，过表达MdWRKY75植株叶片萎蔫和卷曲程度较野生型（WT）更低，叶绿素和叶片相对含水量显著高于WT，相对离子渗透率（REL）和丙二醛（MDA）含量显著低于WT，RNAi植株则相反。过表达MdWRKY75显著增强了植株在干旱胁迫下的叶绿素荧光和光合参数，RNAi株系中这些参数较WT则显著降低。此外，MdWRKY75通过增强抗氧化酶活性并降低活性氧积累来增强苹果植株抗旱性。同时，MdWRKY75可以促进ABA信号介导的气孔关闭来提高苹果抗旱性。干旱处理后，与WT相比，过表达植株的ABA含量和信号途径部分基因的表达量显著升高，RNAi植株显著降低。 2.MdWRKY75促进ABA信号介导的气孔关闭提高苹果抗旱性。通过qRT-PCR和DAP-seq试验筛选到MdWRKY75在干旱胁迫下的潜在靶基因MdCAR4（C2-domainABA-related4），酵母单杂交（Y1H）、凝胶迁移试验（EMSA）、β-葡萄糖苷酸酶（GUS）试验和双荧光素酶（Dual-luciferase）试验表明MdWRKY75直接结合MdCAR4的启动子并激活其表达。通过遗传转化获得了MdCAR4的RNAi苹果植株，对其进行干旱胁迫处理后发现，与WT相比，干扰MdCAR4的苹果植株叶片萎蔫和卷曲程度更高，叶绿素含量和叶片相对含水量更低，REL值和MDA含量更高；同时，与WT相比，干扰MdCAR4显著降低了干旱下苹果植株的叶绿素荧光和光合参数，抑制了抗氧化酶的活性，进而提高了活性氧水平。此外，干扰MdCAR4的苹果植株在干旱胁迫下ABA含量较WT显著降低，气孔开张度变大，部分ABA通路相关基因表达量显著下调，表明干扰MdCAR4植株的干旱敏感性是通过减弱ABA介导的气孔关闭造成的。进一步研究发现，酵母双杂交（Y2H）、荧光素酶互补（Split-LUC）、pull-down和双分子荧光互补（BiFC）试验表明，MdCAR4与ABA受体家族的MdPYL3、MdPYL4.2、MdPYL5和MdPYL6存在互作关系。 3.MdWRKY75正调节MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d的表达提高苹果耐热性。过表达MdWRKY75的植株减轻了苹果在热胁迫下的损伤，抑制了叶绿素的降解、积累了更高的脯氨酸含量；抑制了电解质的外渗，具有较低的相对电导率和丙二醛；RNAi株系则相反。与WT相比，过表达MdWRKY75的苹果植株在热胁迫下的叶绿素荧光和光合参数显著提高，抗氧化酶活性显著增强，ROS显著降低，RNAi植株则相反。利用RNA-seq和qRT-PCR筛选到MdWRKY75的潜在靶基因MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d。Y1H、EMSA、GUS和Dual-luciferase试验结果显示MdWRKY75直接结合MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d的启动子并正调节它们的表达。利用瞬时转化获得了MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d的过表达植株并进行了热处理。结果表明，热胁迫处理后，过表达这3个MdHsfs的植株较野生型萎蔫程度减轻。将3个MdHsfs分别与MdWRKY75-Ri3共表达并进行热胁迫处理，发现共表达后能明显挽救MdWRKY75-Ri3的热敏感表型，植株萎蔫程度下降。 4.热激蛋白MdHSC70与MdWRKY75互作降低了热胁迫下MdWRKY75对MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d的调控。通过Y2H筛库筛选到了MdWRKY75的潜在互作蛋白，热激蛋白MdHSC70，通过Split-LUC、BiFC和pull-down试验证实了二者的互作关系。MdHSC70瞬时过表达苹果株系在热胁迫下萎蔫程度较野生型更严重，MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d的表达量较野生型显著降低。与野生型相比，苹果MdHSC70VIGS沉默株系耐热性更强，MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d的表达量更高，表明MdHSC70负调节苹果耐热性。GUS、Dual-luciferase和EMSA试验表明，MdHSC70通过与MdWRKY75互作并降低了MdWRKY75对MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d的调控。在MdWRKY75-OE3的植株上对MdHSC70分别进行过表达和沉默，热处理后的结果表明，过表达MdHSC70降低了MdWRKY75-OE3的耐热性，MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d的表达量显著降低，沉默MdHSC70则与MdWRKY75-OE3的耐热性相当。
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